周期性張應(yīng)變對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 生物體在從器官、組織到細(xì)胞等各個(gè)層次上的生命活動(dòng)均離不開(kāi)一定的力學(xué)環(huán)境。作為生命基本組成單元的細(xì)胞，其生存的力學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝臟分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位。如何控制HSC的活性從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程是抗肝纖維化研究的重點(diǎn)之一。慢性肝炎往往伴隨著門(mén)脈高壓癥，高門(mén)脈壓力會(huì)使肝竇擴(kuò)張，HSC受到的牽張力增大。國(guó)

2、內(nèi)外對(duì)機(jī)械牽張對(duì)HSC生物性狀的影響的研究甚少。本研究通過(guò)應(yīng)用程序化細(xì)胞牽拉裝置Flexercell Strain Unit 2000，對(duì)體外培養(yǎng)的HSC施與循環(huán)機(jī)械牽拉造成周期性張應(yīng)變，并研究其對(duì)HSC生物學(xué)活性的影響，探討張應(yīng)變?cè)贖SC活化、增殖、生成ECM等功能改變中所起的作用及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用酶消化—密度梯度離心法分離大鼠HSC。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照Control組（Con）、單純牽拉Stretch

3、組（MS）、牽拉+cRGDfV (AM100)組（AM）、牽拉+SB202190組（SB）、牽拉+wortmannin組（wort）、牽拉+PD98059組（PD）共六組。細(xì)胞培養(yǎng)于BioFlex六孔板，生長(zhǎng)至合適密度后，換成含1％ FBS的DMEM培養(yǎng)液同步化24小時(shí)，含抑制劑的四組細(xì)胞用含相應(yīng)工作濃度的抑制劑工作液處理，對(duì)照組與單純牽拉組細(xì)胞用含0.5‰ DMSO和1％ BSA的DMEM培養(yǎng)液處理；1小時(shí)后給除對(duì)照組外的其他組細(xì)胞施

4、加周期性張應(yīng)變（牽拉條件為10％幅度，0.5 Hz頻率，24 h時(shí)間）。牽拉完畢后檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移等功能，提取總RNA行PCR檢測(cè)各種細(xì)胞活化相關(guān)因子的基因表達(dá)，提取總蛋白行western blot檢測(cè)多種信號(hào)蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方法采用單因素方差分析，顯著性P<0.05認(rèn)為總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多重比較選用Tukey檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 一

5、、HSC的分離與鑒定：應(yīng)用密度梯度離心法成功分離出靜止期大鼠HSC，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定HSC存活率95％以上；Desmin、α-SMA免疫熒光鑒定靜止與活化HSC細(xì)胞純度達(dá)95％以上。細(xì)胞正常培養(yǎng)5-7天左右自行活化，生長(zhǎng)繁殖明顯增強(qiáng)，傳代培養(yǎng)5次后生長(zhǎng)繁殖能力下降。
　　 二、不同牽拉條件對(duì)HSC的影響
　　 當(dāng)牽拉參數(shù)設(shè)置為10％幅度、0.5 Hz頻率、24小時(shí)的時(shí)候，牽拉組HSC的膠原基因生成不僅比對(duì)照組顯著增加，也是

6、各種條件中差異比較明顯而穩(wěn)定的一個(gè)狀態(tài)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均使用10％幅度、0.5赫茲、24小時(shí)的牽拉條件。
　　 三、周期性張應(yīng)變對(duì)HSC生物活性的影響
　　 周期性張應(yīng)變能顯著促進(jìn)HSC增殖，給予整合素αvβ3抑制劑cRGDfV能夠抑制周期性張應(yīng)變的促增殖效應(yīng)。周期性張應(yīng)變明顯促進(jìn)了HSC的α-SMA的表達(dá)，同時(shí)也促進(jìn)TGF-beta 1與CTGF等促纖維化因子的表達(dá)，提示周期性張應(yīng)變促進(jìn)HSC的增殖與活化，是部分通過(guò)促進(jìn)

7、TGF-β1與CTGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。另外本實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到周期性張應(yīng)變影響PDGF-B及其受體PDGFR-B表達(dá)，提示周期性張應(yīng)變的促增殖活化作用與PDGF-B通路無(wú)關(guān)。周期性張應(yīng)變能夠顯著促進(jìn)HSC的I型膠原α1鏈（COL1A1）和III型膠原α1鏈（COL3A1）的mRNA表達(dá)，其中以COL3A1更為明顯；該作用能夠被cRGDfV所抑制。通過(guò)劃痕與Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，周期性張應(yīng)變單獨(dú)作用對(duì)HSC的遷移影響不明顯，但是能夠增強(qiáng)PD

8、GF所誘導(dǎo)的HSC遷移。而通過(guò)抑制αvβ3整合素的活化，周期性張應(yīng)變的促增殖、活化與遷移影響明顯減弱。綜合前述結(jié)果，本部分研究發(fā)現(xiàn)提示在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，一方面直接通過(guò)整合素途徑，促進(jìn)TGF-beta、CTGF等促纖維化因子，促使HSC的增殖活化，從而直接參與了肝纖維化的發(fā)生；另一方面，通過(guò)激活整合素途徑，協(xié)同細(xì)胞因子PDGF增強(qiáng)HSC的遷移能力，加快肝纖維化的進(jìn)展。肝硬化門(mén)脈高壓癥引起HSC受到的張應(yīng)變?cè)黾?，而張?yīng)變通過(guò)促進(jìn)HS

9、C的纖維生成作用而反饋加重門(mén)脈高壓，提示張應(yīng)變對(duì)門(mén)脈高壓癥狀的維持和發(fā)展可能起到一定的作用。
　　 四、周期性張應(yīng)變調(diào)節(jié)HSC功能的機(jī)制研究
　　 結(jié)果說(shuō)明周期性張應(yīng)變能夠明顯增強(qiáng)整合素β3、p38、Akt、ERK1/2的磷酸化。cRGDfV不能抑制HSC的整合素β3亞基磷酸化，但能抑制細(xì)胞內(nèi)粘附斑激酶FAK的磷酸化水平。Akt、p38、ERK1/2磷酸化抑制劑wortmannin、SB202190、PD98059分別能

10、夠明顯降低HSC相應(yīng)蛋白磷酸化水平。周期性張應(yīng)變能夠明顯增強(qiáng)HSC增殖蛋白PCNA的表達(dá)，并促進(jìn)α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表達(dá)；應(yīng)用cRGDfV或能夠明顯抑制張應(yīng)變的這些促增殖活化效應(yīng)；而應(yīng)用SB202190，Wortmannin，PD98059能夠部分抑制張應(yīng)變的這些效應(yīng)。這些結(jié)果提示周期性張應(yīng)變對(duì)HSC的影響是通過(guò)激活整合素αvβ3，活化FAK這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的；而αvβ3，F(xiàn)AK之后的通路可能與MAPK和Ak

11、t通路相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功在體外分離出大鼠靜止HSC，分離出的靜止HSC能夠傳代培養(yǎng)多次并在培養(yǎng)過(guò)程中自行活化。
　　 2、周期性張應(yīng)變能明顯促進(jìn)HSC的I型膠原α1鏈的基因表達(dá)，特別是在牽拉幅度為10％，牽拉頻率為0.5 Hz，牽拉時(shí)間為24小時(shí)的牽拉條件下促進(jìn)效果最顯著。
　　 3、周期性張應(yīng)變能明顯促進(jìn)HSC的增殖和活化，并促進(jìn)了PDGF-BB介導(dǎo)下的HSC遷移，提示張應(yīng)變能夠增強(qiáng)H