化濁解毒中藥血清及補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的影響.pdf

1、肝纖維化是以結(jié)節(jié)形成和肝臟收縮為特征，是肝臟疾病末期的所有并發(fā)癥包括門脈高壓、腹水、肝性腦病、合成及代謝功能障礙的基礎(chǔ)，因此肝纖維化既損傷肝細(xì)胞的功能又能增加門靜脈壓力。幾乎在所有的慢性肝損傷的病人中都會(huì)產(chǎn)生纖維化，最終形成肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重影響人的生命。目前一般認(rèn)為肝纖維化發(fā)生的原理為：肝纖維化是肝臟發(fā)生慢性非自限性損傷之后的一個(gè)創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)；激活的肝星狀細(xì)胞是肝纖維化形成最主要的細(xì)胞。
　　 肝纖維化最主要的事件是肝星狀細(xì)

2、胞的活化，肝星狀細(xì)胞是正常和纖維化肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的基本來源，是肝細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的內(nèi)皮下間隙非游走的竇旁細(xì)胞，是體內(nèi)儲(chǔ)存視黃醛衍生物的首要部位，在星狀細(xì)胞被激活的過程中，靜止的富含維生素A的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高度致纖維化的細(xì)胞，其形態(tài)特征為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大、維生素A顆粒減少、核膜皺縮，出現(xiàn)可收縮性的纖維絲及細(xì)胞增殖。被激活的肝星狀細(xì)胞造成肝纖維化的最直接的方式就是增加細(xì)胞外基質(zhì)的形成。細(xì)胞外基質(zhì)是指一系列參與構(gòu)成正常肝和纖維化肝間質(zhì)框架的大分

3、子，包括幾個(gè)結(jié)構(gòu)和支撐分子家族：膠原、非膠原糖蛋白、基質(zhì)結(jié)合生長因子、黏多糖、蛋白多糖和基質(zhì)細(xì)胞蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞功能的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)器，纖維化肝臟的基質(zhì)成分在性質(zhì)和含量上均有別于正常肝臟，其膠原總含量增加了3～10倍，在肝損傷區(qū)域內(nèi)首先出現(xiàn)的基質(zhì)改變是細(xì)胞纖連蛋白的增加，這些變化導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的激活和纖維化速度的增加。而激活后的肝星狀細(xì)胞表達(dá)針對(duì)膠原和層粘連蛋白的整合素受體則又有助于基質(zhì)成分的沉積。最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，

4、造成細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。
　　 研究表明纖維化在多種疾病中可以被逆轉(zhuǎn)，如酒精性肝病隨著戒酒，其肝纖維化可被顯著逆轉(zhuǎn)；乙肝患者在應(yīng)用抗病毒藥拉米夫定之后肝纖維化程度也顯著改善；丙肝患者應(yīng)用干擾素和利巴韋林之后肝纖維化有短期的退化或肝纖維化進(jìn)展減緩。
　　 目前肝纖維化的治療主要集中在(1)治愈原發(fā)疾病如清除慢性病毒性感染；戒酒和停用有毒性的藥物；去除過剩的鐵和銅；解除膽道梗阻等。(2)減輕炎癥和免疫反應(yīng)。(3)抑制星狀細(xì)

5、胞的活化包括能夠抑制星狀細(xì)胞增殖、促進(jìn)星狀細(xì)胞凋亡、抑制膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成；增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解，起到抗纖維形成的作用。
　　 現(xiàn)在研究多將肝星狀細(xì)胞作為治療肝纖維化的靶點(diǎn)。治療上多用抗氧化劑如生育酚、水飛薊素等，可以經(jīng)保護(hù)肝細(xì)胞和抑制庫普弗細(xì)胞功能的雙重作用減少肝損傷。另一類為抑制細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)，主要是通過直接阻斷基質(zhì)合成和處理或間接抑制轉(zhuǎn)化生子因子(TGF-β)的活性而實(shí)現(xiàn)，由于中和轉(zhuǎn)化生長因子能夠取得加速基質(zhì)降解

6、和抑制基質(zhì)產(chǎn)生的雙重效果，所以轉(zhuǎn)化生長因子拮抗劑也是目前的熱點(diǎn)，如松弛肽等。PPAR-γ在星狀細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，其配體可以下調(diào)星狀細(xì)胞的活性，在活化的肝星狀細(xì)胞中PPAR-γ表達(dá)顯著減少。上調(diào)PPAR-γ表達(dá)能夠使肝星狀細(xì)胞從激活態(tài)轉(zhuǎn)為靜止態(tài)，從而抑制肝星狀細(xì)胞活性。所以本實(shí)驗(yàn)將肝星狀細(xì)胞及TGF-β和PPAR-γ作為靶點(diǎn)觀察化濁解毒方的作用機(jī)制。
　　 中醫(yī)多將肝纖維化、肝硬化歸為“癥積”“臌脹”“積聚”等范疇。歷代醫(yī)家多認(rèn)為是由

7、氣血瘀滯造成，多用活血化瘀、軟肝散結(jié)之品治療，雖能取效，但是也僅能治標(biāo)而不治本。經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐，導(dǎo)師李佃貴教授認(rèn)為濁毒在肝纖維化形成中起著關(guān)鍵作用。濁毒內(nèi)蘊(yùn)可以影響肝的疏泄功能，導(dǎo)致氣機(jī)郁滯，血不歸藏，變生諸癥，日久正虛，濁毒與虛共同致病。故治療上固本與驅(qū)邢不可偏廢，以化濁解毒為大法，兼補(bǔ)益肝腎，經(jīng)多年臨床驗(yàn)證化濁解毒方在臨床應(yīng)用中取得良好的效果，但是對(duì)其作用機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平觀察化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞的作用，從而

8、探討其作用機(jī)制。
　　 在治療肝纖維化的中藥復(fù)方中除了大劑量的應(yīng)用化濁解毒、軟肝散結(jié)、活血化瘀之品外，根據(jù)中醫(yī)的辨證論治的原則我們會(huì)選擇性的應(yīng)用一些補(bǔ)益肝腎的藥物其中較常用的是補(bǔ)骨脂，其主要成分是補(bǔ)骨脂素，結(jié)合現(xiàn)代研究，在治療肝纖維化中的天然黃酮類藥物的應(yīng)用如水飛薊素，姜黃素等能夠通過抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成而阻止肝纖維化的發(fā)生和肝硬化的形成。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素也有很多與姜黃素相似的作用，我們推測(cè)屬于

9、香豆素類化合物補(bǔ)骨脂素有可能也具有類似的防治肝纖維化作用，所以本實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的作用，從而觀察其在肝纖維化治療中的作用機(jī)理。進(jìn)而研究化濁毒與抗氧化應(yīng)激之間是否存在一定聯(lián)系。本研究將分五部分來探討化濁解毒中藥血清及補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的影響。
　　 第一部分化濁解毒中藥血清對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　 目的：化濁解毒方是臨床上治療肝纖維化的驗(yàn)方，但對(duì)其作用機(jī)理缺乏研究。本研

10、究通過觀察化濁解毒中藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討化濁解毒方治療肝纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法：選擇健康的SD大鼠，制備含藥血清，分為干擾素組（陽性對(duì)照組），化濁解毒方大、中、小劑量組及空白對(duì)照組。體外培養(yǎng)活化的肝星狀細(xì)胞，加入各含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，利用MTT法觀察化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響；培養(yǎng)48小時(shí)后運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析各組肝星狀細(xì)胞的凋亡情況。
　　

11、結(jié)果：肝星狀細(xì)胞在不同濃度化濁解毒中藥血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，與空白對(duì)照組比較，大劑量組（0.216士0.051）和陽性對(duì)照組（0.232士0.029）有抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用(P＜0.05)；培養(yǎng)48h后，化濁解毒中藥血清各劑量組均有抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用，其中大劑量組(0.160士0.044)效果更為明顯（P＜0.05），且與陽性對(duì)照組（0.20士0.039）比較無差別，其效果優(yōu)于中（0.266±0.046）、小劑量組（0.31

12、5士0.043）（P＜0.05）；培養(yǎng)72h后，陽性對(duì)照組和化濁解毒中藥血清各劑量組均有明顯的抑制HSC-T6增殖的作用（P＜0.05），且化濁解毒中藥血清大劑量組效果優(yōu)于陽性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分析后顯示：肝星狀細(xì)胞經(jīng)過含藥血清干預(yù)48h后，空白對(duì)照組的凋亡率約2.68％,即說明正常的肝星狀細(xì)胞也存在著凋亡，陽性對(duì)照組15.78％和化濁解毒中藥血清各組的凋亡率均較空白對(duì)照組高(P＜0.05)；與陽性對(duì)

13、照組比較，化濁解毒中藥血清的大劑量組的細(xì)胞凋亡率更高為20.02％(P＜0.05)；中劑量組細(xì)胞凋亡率13.38％與陽性對(duì)照組沒有明顯差別(P＞0.05)，小劑量組的凋亡率12.88％要低于陽性對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：化濁解毒中藥血清各濃度組在體外均能夠抑制肝星狀細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)存在一定的量效關(guān)系，即濃度越大其抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用越強(qiáng)。與干擾素組比較，化濁解毒中藥血清尤其是大劑量組能有效的抑制肝星狀

14、細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡。
　　 第二部分化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的影響
　　 目的：本部分實(shí)驗(yàn)主要觀察化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)尤其是對(duì)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的影響。
　　 方法：肝星狀細(xì)胞加入含藥血清后培養(yǎng)48小時(shí)后，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的影響。
　　 結(jié)果：肝星狀細(xì)胞在不同濃度化

15、濁解毒中藥血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，與空白對(duì)照組比較，各組均能抑制肝星狀細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸。其中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量在大劑量組（分別為117.9ng·mL-1，56.3ng·mL-1）最低，其作用效果明顯優(yōu)于中(158.0ng·mL-1，70.9ng·mL-1)、小劑量組（162.6ng·mL-1，79.6ng·mL-1）及陽性對(duì)照組(148.3ng·mL-1，64.3ng·mL-1)(P＜0.05)；

16、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸的含量在大劑量組（60.1ng·mL-1，31.2ng·mL-1）與陽性對(duì)照組（60.0±5.1ng·mL-1，32.8±4.1ng·mL-1）均較低，兩組之間無明顯差異(P＞0.05)，均優(yōu)于中藥的中、小劑量組（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：化濁解毒中藥血清能夠減少體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，包括降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸和層粘連蛋白的含量。
　　 第三部分化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)

17、胞TGF-β/Smad4信號(hào)通路的影響
　　 目的：觀察化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)TGF-β1mRNA和Smad4mRNA的影響。
　　 方法：運(yùn)用RT-PCR方法觀察化濁解毒中藥血清各濃度組對(duì)TGF-β1mRNA和Smad4mRNA基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：經(jīng)化濁解毒中藥血清干預(yù)48小時(shí)后，化濁解毒方各劑量組的TGF-β1mRNA表達(dá)均較正常血清對(duì)照組顯著減少(P＜0.05)。各組的Smad4mRNA表

18、達(dá)量均顯著減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：化濁解毒中藥血清抑制肝星狀細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡及減少合成細(xì)胞外基質(zhì)可能是通過下調(diào)TGF-β1mRNA與Smad4mRNA表達(dá)，影響TGF-β/Smad4通路起作用。
　　 第四部分化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞PPARγmRNA的影響
　　 目的：本研究將觀察化濁解毒中藥血清對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)PPARγ的影響，并最終發(fā)現(xiàn)對(duì)PPARγ及TGF-β/Smad通路的作用，進(jìn)一步明

19、確化濁解毒中藥血清抗肝纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法：運(yùn)用RT-PCR方法觀察化濁解毒中藥血清各濃度組對(duì)PPARγmRNA基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，各組的PPARγmRNA表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05)。其中化濁解毒中藥血清大劑量組的PPARγmRNA表達(dá)量明顯優(yōu)于陽性對(duì)照組和中、小劑量組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：化濁解毒中藥血清能夠增加肝星狀細(xì)胞內(nèi)PPARγmRNA的表達(dá)量，以化濁

20、解毒中藥血清大劑量組最為明顯，這也表明了化濁解毒方之所以能干預(yù)TGF-β/Smad信號(hào)通路可能是通過上調(diào)PPARγmRNA來起作用的。
　　 第五部分補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖及活性的影響
　　 目的：觀察化濁解毒方中補(bǔ)骨脂所含有的主要成分補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及活性的影響。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，并用0.1mmo.L-1的H2O2造成HSC-T6氧化應(yīng)激的模型。加入補(bǔ)骨脂素，并用MTT法、放射免疫法

21、和ELISA法分別檢測(cè)肝星狀細(xì)胞增殖、細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，還原性谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及Ⅰ型膠原的含量。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，補(bǔ)骨脂素在濃度為10μmol·L-1，1μmol·L-1，0.1μmol·L-1，均呈現(xiàn)出抑制HSC增殖的作用（P＜0.05），且效果最好的是在作用48h(P＜0.05)；與模型組比較，補(bǔ)骨脂素各個(gè)濃度組能夠提高SOD和GSH-

22、PX的活性(P＜0.05)，并降低細(xì)胞上清液中MDA和GSH的含量(P＜0.05)；與模型組比較，補(bǔ)骨脂素各個(gè)濃度組在作用48h后，細(xì)胞上清液中的Ⅰ型膠原的表達(dá)量均降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：補(bǔ)骨脂素能有效的抑制肝星狀細(xì)胞的增殖及氧化應(yīng)激，說明補(bǔ)骨脂素是化濁解毒中藥血清治療肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，從另一層面上也說明了濁毒導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制可能和氧化應(yīng)激有關(guān)，化濁毒的方法之所以能在治療肝纖維化中起作用，很可能與其中的抗氧化

23、成分有關(guān)，即化濁毒與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　 總論
　　 1 化濁解毒中藥血清各濃度組均能夠抑制肝星狀細(xì)胞的增殖。
　　 2 化濁解毒中藥血清各濃度組均促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡。
　　 3 化濁解毒中藥血清各濃度組均能抑制HSCs細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸和層粘連蛋白。
　　 4 經(jīng)化濁解毒中藥血清干預(yù)后，化濁解毒中藥血清大劑量組的HSC內(nèi)TGF-β1mRNA表達(dá)量明顯降低。
　　 5

24、 化濁解毒中藥血清大劑量組的Smad4mRNA表達(dá)量明顯低于中、小劑量組(P＜0.05)。
　　 6 化濁解毒中藥血清大劑量組的PPARγmRNA表達(dá)量明顯優(yōu)于陽性對(duì)照組和中、小劑量組。
　　 7 化濁解毒方防治肝纖維化的機(jī)制可能是通過上調(diào)PPARγmRNA表達(dá)而干預(yù)肝星狀細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad4信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡和抑制肝星狀細(xì)胞的增殖及減少其分泌細(xì)胞外基質(zhì)含量而實(shí)現(xiàn)的。
　　 8 不同濃度補(bǔ)骨