蠶蛹粉對(duì)rhGM-CSF口服吸收影響的研究.pdf

1、蛋白藥物口服一直是世界性難題，本研究擬通過(guò)從蠶蛹粉中分離某一類蛋白，以其作為載藥材料，配制新型重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)口服劑型，為口服蛋白藥物的發(fā)展打下一定的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中以蠶蛹粉作為載藥材料，混合rhGM-CSF藥品，口服給藥昆明小鼠，灌胃后于15min，40min，60min，120min時(shí)間點(diǎn)取血，ELISA結(jié)果表明蠶蛹粉與rhGM-CSF混合物的實(shí)驗(yàn)組在給藥40min后時(shí)，血清中rhGM-CSF的濃度

2、最高，并且是只口服rhGM-CSF藥品的兩倍。為了從蠶蛹粉中尋找?guī)椭鷕hGM-CSF口服吸收的有效成分，研究中通過(guò)勻漿和離心將蠶蛹粉分為可溶組分和不可溶組分，即上清和沉淀兩部分。ELISA結(jié)果顯示給藥40min后，上清與rhGM-CSF混合物組的血藥濃度是沉淀與rhGM-CSF混合物組的四倍，表明蠶蛹粉有效成分大部分位于上清成分中。
　　 利用硫酸銨沉淀法分離上清溶液中的蛋白，沉淀下蛋白用PBS(pH7.6)重新溶解后，利用不同

3、孔徑大小(2kDa，10kDa，30kDa和100kDa)的超濾膜截留，分別獲得各超濾膜的截留液。各截留液制成凍干粉后，分別作為載藥材料混合rhGM-CSF藥品口服給藥昆明小鼠。ELISA的結(jié)果顯示，10kDa超濾膜截留液的凍干粉促進(jìn)rhGM-CSF口服吸收的效果最大，100kDa超濾膜截留液的凍干粉的作用效果次之，30kDa超濾膜截留液的凍干粉幾乎沒(méi)有作用。rhGM-CSF藥品與10kDa超濾膜截留液的凍干粉以不同比例混合后口服給藥進(jìn)

4、行藥代動(dòng)力學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10kDa超濾膜截留液的凍干粉的作用效果與混合物中10kDa超濾膜截留液的凍干粉的比例相關(guān)，混合物中10kDa超濾膜截留液的比例越大血清中rhGM-CSF的濃度越高，兩者呈正相關(guān)性且血藥濃度。
　　 各截留液液凍干粉BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE和Tricin-SDS-PAGE的分析，結(jié)果顯示2kDa超濾膜截留液中幾乎沒(méi)有蛋白，10kDa超濾膜截留液中的蛋白主要是10-20kDa蛋白群和少量的

5、30kDa蛋白;30kDa超濾膜截留液中的蛋白80％是30kDa蛋白;100kDa超濾膜截留液中的蛋白主要是30kDa蛋白和80kDa蛋白群。以上實(shí)驗(yàn)表明，蠶蛹粉中促進(jìn)rhGM-CSF口服吸收的有效成分是10-20kDa蛋白。
　　 免疫共沉淀分析表明在10kDa超濾膜截留液中未發(fā)現(xiàn)rhGM-CSF的相互作用蛋白，說(shuō)明10-20kDa蛋白不是通過(guò)與rhGM-CSF結(jié)合成復(fù)合物從而促進(jìn)rhGM-CSF口服吸收。MALDITOFMS

6、和LTQMS分析10-20kDa蛋白，結(jié)果表明10-20kDa蛋白主要是ubiquitin，chymotrypsininhibitor,CationicpeptideCP8precursor,Kazal-typeproteinaseinhibitor,RecName:Full=ChymotrypsininhibitorSCI-(Ⅱ)和RecName:Full=ChymotrypsininhibitorSCI-(Ⅰ)。除ubiquitin