Ezrin-ACAP4蛋白復(fù)合物在胞吐動(dòng)力學(xué)調(diào)控中的功能研究.pdf

1、細(xì)胞可塑性與動(dòng)力學(xué)特征是維系組織及器官功能特異性及個(gè)體健康的基礎(chǔ)，在分子水平上細(xì)胞可塑性與動(dòng)力學(xué)特征則體現(xiàn)為蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空調(diào)節(jié)。細(xì)胞極化是行使其功能區(qū)域化的基礎(chǔ)，亦是細(xì)胞可塑性與動(dòng)力學(xué)特征的綜合表征之一。胃壁上皮細(xì)胞是一個(gè)典型的極化細(xì)胞，負(fù)責(zé)胃酸與內(nèi)因子的分泌。為此，胃壁細(xì)胞酸分泌不僅為研究胞吐分子機(jī)制提供了一個(gè)極好的模式體系，同時(shí)對(duì)其機(jī)制的研究亦為闡明胃壁細(xì)胞分子生理學(xué)及校正胃酸分泌異常奠定基礎(chǔ)。 幽門(mén)螺旋桿菌長(zhǎng)久地駐留

2、于人類腸胃之中，是人類多種胃病的罪魁禍?zhǔn)?，與萎縮性胃炎、胃癌等休戚相關(guān)。雖然很久之前人們已經(jīng)知道幽門(mén)螺旋桿菌感染能夠?qū)е挛杆岱置诘臏p少，但其分子機(jī)制至今仍然懸而未決。以往的研究多集中在免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，我們的研究結(jié)果表明，VacA毒素能夠直接誘導(dǎo)胃壁細(xì)胞頂膜通透性的增加，導(dǎo)致胃酸分泌的減少。為此，我們建立了原代培養(yǎng)的胃腺、胃壁細(xì)胞等研究模型和良好的評(píng)估壁細(xì)胞分泌能力的技術(shù)平臺(tái)，包括氨基比林吸收實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦掃描技術(shù)等，對(duì)VacA感染所導(dǎo)致

3、的壁細(xì)胞生理特征的改變進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。結(jié)果表明：VacA誘導(dǎo)的細(xì)胞膜通透性的增加導(dǎo)致了胞外鈣離子的內(nèi)流，進(jìn)而引起胞內(nèi)鈣依賴性蛋白水解酶Calpain Ⅰ蛋白酶的活化，將Ezrin在469與470之間進(jìn)行切開(kāi)，從而使得Ezrin分子從壁細(xì)胞膜上脫離下來(lái)。Ezrin是一個(gè)膜蛋白與皮層骨架之間的連接器，它還參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在壁細(xì)胞中，它定位于頂膜，并受到PKA磷酸化修飾的調(diào)控，進(jìn)而影響到HCl的分泌。VacA處理的細(xì)胞通過(guò)阻止H,K

4、-ATPase管狀囊泡到頂膜上的招募抑制了胃酸的分泌。電鏡結(jié)果也顯示，VacA處理導(dǎo)致了Ezrin在壁細(xì)胞中完整性的缺失，破壞了壁細(xì)胞頂膜微絨毛中肌動(dòng)蛋白纖維的放射狀排布。值得關(guān)注的是：在外源性表達(dá)Ezrin水解位點(diǎn)突變體的壁細(xì)胞中，雖然進(jìn)行了VacA感染的處理，但其依然能夠保持泌酸功能的正常進(jìn)行。我們對(duì)VacA感染的細(xì)胞中Ezrin的水解現(xiàn)象進(jìn)行研究，為全面地認(rèn)識(shí)幽門(mén)螺旋桿菌誘導(dǎo)胃酸分泌減少的現(xiàn)象提供了一個(gè)全新的方位。我們的結(jié)果表明，

5、VacA能夠破壞胃壁細(xì)胞頂膜與骨架之間的精細(xì)連接，進(jìn)而引發(fā)胃酸分泌的減少。 在研究細(xì)胞膜與微絲骨架動(dòng)力學(xué)調(diào)控機(jī)制過(guò)程中我們鑒定出一個(gè)新的蛋白復(fù)合體，其中包括Ezrin-ACAP4-Arf6。然而，ACAP4與Ezrin之間是否存在著直接的相互作用，它們之間又是如何協(xié)調(diào)控制著膜-骨架之間的重構(gòu)還不是很清楚。利用壁細(xì)胞酸分泌為模式體系，我們發(fā)現(xiàn)：Ezrin能夠依賴PKA介導(dǎo)的磷酸化修飾與ACAP4相互作用。我們的體外生化研究結(jié)果表明

6、，ACAP4依賴其氨基端400個(gè)氨基酸區(qū)域與模擬磷酸化狀態(tài)的Ezrin相互作用，這說(shuō)明它們之間的相互作用依賴于蛋白自身的構(gòu)象變化。更為重要的是，在分泌性的壁細(xì)胞中，Ezrin特異性地將ACAP4靶向到頂膜，不論是敲除掉Ezrin，還是表達(dá)缺失Ezrin結(jié)合區(qū)域的ACAP4的片斷，都削弱了ACAP4在頂膜的定位。ACAP4是一個(gè)Arf6特異性的GTP酶激活蛋白，它能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Arf6-GTP。過(guò)量表達(dá)GAP活性缺陷型的ACAP4

7、突變體抑制了頂膜-骨架的重構(gòu)和壁細(xì)胞酸的分泌?？傊覀兊慕Y(jié)果為Arf6-ACAP4-Ezrin之間的相互作用和極化上皮細(xì)胞的分泌之間提供了一個(gè)全新的分子機(jī)制的詮釋。綜上所述，本研究闡述了Aff6-ACAP4-ezrin蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)在壁細(xì)胞酸分泌過(guò)程中的重要作用及調(diào)控分子機(jī)制，同時(shí)我們研究揭示了幽門(mén)螺旋桿菌直接作用于壁細(xì)胞并干擾胃酸分泌的病理學(xué)分子機(jī)制。因此，本研究為系統(tǒng)闡明胃壁細(xì)胞分子生理學(xué)及防治壁細(xì)胞生理學(xué)異常所致的消化道疾病提供