微絲成核相關(guān)蛋白因子WASH復(fù)合物、Arp2-3復(fù)合物和FMNL1在卵母細(xì)胞成熟過程中的分子調(diào)控.pdf

1、哺乳動物卵母細(xì)胞成熟過程中的分子調(diào)控是精細(xì)的多階段有序調(diào)控過程，任何缺陷和異常都有可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟或受精卵發(fā)育的障礙。細(xì)胞骨架（微絲和微管）的組裝及其動態(tài)變化，促使卵母細(xì)胞發(fā)生皮質(zhì)重組與極化，并排出第一極體。卵母細(xì)胞的成熟是一種獨特的不均等分裂的過程，在此過程中是微絲形成的微絲流推動著紡錘體的遷移，促使卵母細(xì)胞完成不均等分裂。因此微絲的組裝及動態(tài)變化是卵母細(xì)胞不均等分裂的關(guān)鍵調(diào)控因素。微絲成核因子是調(diào)控微絲的成核，聚合以及組裝的蛋白

2、。研究發(fā)現(xiàn)，微絲成核因子主要包括三大類:第一類是Arp2/3復(fù)合物及其成核促進(jìn)因子（nucleation-promoting factors，NPFs）。Arp2/3復(fù)合物被認(rèn)為是直接成核微絲的最關(guān)鍵的調(diào)控因子，其在卵母細(xì)胞不均等分裂中的作用是依賴于NPFs。近些年來在一些模式動物的卵母細(xì)胞成熟過程中有一些相關(guān)研究，但其在大型哺乳動物卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)和功能仍無驗證性研究。NPFs能夠激活A(yù)rp2/3來成核微絲，并參與微絲介導(dǎo)的一

3、系列細(xì)胞進(jìn)程。其中WASH復(fù)合物是最新鑒定的微絲成核促進(jìn)因子，并被發(fā)現(xiàn)在果蠅等種屬的微絲介導(dǎo)的卵子發(fā)生中具有重要的作用。第二類是Formin家族蛋白。Formin家族蛋白包含一類重要的子類蛋白家族，稱為透明的相關(guān)formins(diaphanous-related formins，DRFs)。DRFs近些年來被發(fā)現(xiàn)參與許多與微絲相關(guān)的細(xì)胞功能，例如細(xì)胞形態(tài)發(fā)生，胚胎分化，胞質(zhì)分裂及細(xì)胞極性等，其中FMNL1被報道在有絲分裂中定位在微管組

4、織中心(MTOC)，對紡錘體的形成，胞質(zhì)分裂等具有十分重要的作用。第三類是包含WH2區(qū)域的微絲成核因子。近些年來關(guān)于微絲成核因子在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中調(diào)控機制的研究已漸漸成為熱門，但微絲成核因子在哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的分子調(diào)控機制及其作用的蛋白信號通路迄今仍不十分清楚。闡明微絲成核因子在哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的分子機制，對于揭示哺乳動物生殖規(guī)律和機理，提高家畜繁殖效率乃至治療人類不孕不育疾病，均具有重要的研究價值。

5、　　本試驗以雌性ICR小鼠和豬為研究對象，采用體外培養(yǎng)、抑制劑處理、顯微注射MO（morpholino）來阻斷蛋白翻譯、免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡觀察及免疫蛋白印跡(western blot)等方法，研究微絲成核因子調(diào)控哺乳動物卵母細(xì)胞成熟及其作用的蛋白信號通路。首先用免疫熒光染色法標(biāo)記WASH復(fù)合物、Arp2/3復(fù)合物和FMNL1在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各個時期的表達(dá)與定位，隨后分別通過顯微注射特異性morpholino、特異性抗體注射

6、或通過特異性蛋白抑制劑的處理，來阻斷蛋白翻譯、破壞蛋白功能或抑制蛋白表達(dá)，借以研究這些蛋白對卵母細(xì)胞微絲和紡錘體組裝、減數(shù)分裂紡錘體遷移與定位、皮質(zhì)顆粒區(qū)域重組、染色體的排列和分離以及細(xì)胞周期的影響，以期了解這些微絲成核因子蛋白對哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的調(diào)控作用。此外，用蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測上游蛋白或目的蛋白功能破壞后對微絲、微管相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步揭示微絲成核因子蛋白調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的可能的蛋白信號通路，為深入

7、了解微絲成核因子蛋白在哺乳動物卵母細(xì)胞成熟過程中的分子調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。本研究共分3個部分，主要研究結(jié)果如下:
　　試驗一、微絲成核因子促進(jìn)因子WASH復(fù)合物通過調(diào)控Arp2/3復(fù)合物參與小鼠卵母細(xì)胞的成熟過程
　　在受精之前，卵母細(xì)胞需經(jīng)歷不均等分裂的過程，而這個過程主要有微絲調(diào)控。最近，WASH復(fù)合物被鑒定為微絲成核的促進(jìn)因子(actin nucleation promotingfactor，NPF)，并可以激活A(yù)rp2

8、/3復(fù)合物。然而，關(guān)于WASH復(fù)合物的作用，特別是在卵母細(xì)胞極化和不均等分裂中的作用并不清楚。這里，我們研究了WASH復(fù)合物的2個重要的亞基蛋白WASH1和Strumpellin在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用。通過顯微注射WASH1 morpholino或Strumpellin抗體來敲低WASH1蛋白的表達(dá)或干擾Strumpellin蛋白的活性，導(dǎo)致卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著下降，并出現(xiàn)均等分裂的現(xiàn)象。通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，這主要由于紡

9、錘體的遷移失敗引起的?；罴?xì)胞時間延遲顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)，敲低WASH1的蛋白表達(dá)水平后，卵母細(xì)胞膜上及胞質(zhì)中的微絲信號強度降低。此外，敲低WASH1的表達(dá)后Arp2/3復(fù)合物的表達(dá)量顯著降低。因此，我們的結(jié)果表明，WASH復(fù)合物通過調(diào)控Ap2/3復(fù)合物來參與小鼠卵母細(xì)胞中微絲介導(dǎo)第一極體的排出和胞質(zhì)分裂過程。
　　試驗二、微絲成核因子Arp2/3復(fù)合物在豬卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)與功能
　　Arp2/3復(fù)合物是微絲成核的直接調(diào)控

10、因子，并在細(xì)胞極性，細(xì)胞遷移，和細(xì)胞內(nèi)吞等許多細(xì)胞進(jìn)程中起著關(guān)鍵性的作用。在本試驗中，我們研究了Arp2/3復(fù)合物在豬卵母細(xì)胞成熟過程中的作用。免疫熒光染色表明Arp2/3復(fù)合物主要定位在豬卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)域，并且與微絲共定位。用特異性抑制Arp2/3復(fù)合物的生物學(xué)活性的抑制劑CK666處理后，Arp2/3復(fù)合物在卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)顯著降低。同時豬卵母細(xì)胞的成熟率顯著降低，主要表現(xiàn)為卵丘擴散和極體排出失敗。而且，CK666處理后導(dǎo)致

11、微絲帽不能正常形成，微絲在豬卵母細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)和胞質(zhì)中的熒光強度顯著降低。總的來說，我們的結(jié)果表明Arp2/3復(fù)合物通過調(diào)控微絲的成核表達(dá)參與豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的過程。
　　試驗三、微絲成核因子FMNL1通過調(diào)控細(xì)胞骨架的動態(tài)變化參與小鼠卵母細(xì)胞的成熟過程
　　FMNL1(Formin-like1)是Formin家族的蛋白成員，該家族的蛋白是微絲成核因子。盡管FMNL1在有絲分裂細(xì)胞的中被發(fā)現(xiàn)對細(xì)胞粘附，胞質(zhì)分裂，細(xì)胞極化

12、和遷移具有必須的作用，它在哺乳動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用并不清楚。在我們的研究中，我們主要通過顯微注射FMNL1的特異性morpholino(MO)和活細(xì)胞觀察來研究FMNL1在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的功能。免疫熒光染色表明生發(fā)泡破裂后，除了胞質(zhì)中的分布，F(xiàn)MNL1主要定位在紡錘體的2極。敲低FMNL1的蛋白表達(dá)導(dǎo)致第一極體的排出率顯著降低，大極體率顯著升高。時間延遲顯微鏡和免疫熒光分析表明這可能由于微絲的表達(dá)降低導(dǎo)致。微絲帽的消失說

13、明皮質(zhì)區(qū)極性被破壞，這說明紡錘體的遷移和定位異常。同時，紡錘體的形成也受到破壞，這主要是由于磷酸化MAPK的表達(dá)量降低引起的。此外，F(xiàn)MNL1的敲低導(dǎo)致順式高爾基體的標(biāo)記蛋白GM130的定位受到破壞，表達(dá)量也顯著降低。最后，我們發(fā)現(xiàn)小GTP酶RhoA可能作用于FMNL1的上游?？偨Y(jié)起來，我們的結(jié)果說明了FMNL1可能作用于RhoA-FMNL1-GM130/p-MAPK蛋白信號通路調(diào)控微絲和微管的動態(tài)變化，從而影響小鼠卵母細(xì)胞的第一極體的