激活蛋白激酶A信號減輕阿霉素腎病小鼠白蛋白尿并促進腎小球壁層上皮細胞向足細胞分化.pdf

1、背景：腎小球血管上皮細胞（足細胞）與腎小球基底膜（GBM）、毛細血管內(nèi)皮細胞一起構(gòu)成腎小球濾過屏障。各種因素導(dǎo)致的足細胞損傷和丟失都可能導(dǎo)致大量蛋白尿,也與腎臟病進展相關(guān)。成熟的足細胞是一種終末分化的上皮細胞，缺乏分裂增殖能力，不能通過自我增殖來補充丟失的足細胞。因此減少足細胞的損傷和增加足細胞的數(shù)量可能是減輕蛋白尿，延緩腎病進展的一種重要途徑。近期研究發(fā)現(xiàn)壁層上皮細胞（the parietal epithelial cells，PEC

2、s）能在生理及病理情況下表達足細胞蛋白。PECs和足細胞擁有一個共同的細胞起源，同時在解剖位置上兩者相互毗鄰，這使得PECs具有再生足細胞的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)，腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）激動劑Forskolin可通過激活腎小球內(nèi)cAMP信號部分緩解阿霉素腎病誘小鼠白蛋白尿和足細胞丟失。體外實驗發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A(PKA)激動劑pCPT-cAMP可直接激活PKA信號可防止ADR誘導(dǎo)的足細胞凋亡和數(shù)量減少。但是我們不清楚激活cAMP/PKA信號，

3、能否防止阿霉素腎病小鼠中足細胞的損傷和丟失，并促進PECs向足細胞分化。
　　目的：探討PKA激動劑pCPT-cAMP對阿霉素腎病小鼠的保護作用，以及pCPT-cAMP是否促進壁層上皮細胞分化。
　　方法：使用6-8周齡Balb/C雄性小鼠，予以ADR（11mg/kg）尾靜脈注射構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型（ADR組），部分小鼠使用pCPT-cAMP腹腔注射治療（A+P組）。使用蛋白電泳+考馬斯染色方法觀察小鼠尿白蛋白變化；糖原染

4、色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)和六胺銀染色觀察腎臟組織病理學(xué)改變。WT-1免疫組化染色觀察足細胞數(shù)量，synaptopdodin和desmin免疫熒光雙染觀察足細胞的損傷。PCNA和claudin1免疫熒光雙染檢測PECs增殖，CD44和nestin免疫熒光雙染觀察PECs活化，p57和claudin1免疫熒光雙染檢測PECs向足細胞分化。
　　結(jié)果：對照組小鼠尿中無中大分子蛋白，ADR腎病小鼠

5、第二周及第八周時小鼠尿電泳中中大分子蛋白增多，尿白蛋白/肌酐比值顯著升高，pCPT-cAMP治療則降低ADR腎病小鼠的尿白蛋白/肌酐比值，ADR組和A+P組尿白蛋白/肌酐比值第二周分別是8.07±3.95（mg/mg）和6.06±5.8（mg/mg），P<0.05。第八周時兩組尿白蛋白/肌酐比值分別是21.83±12.7（mg/mg）和6.37±3.78（mg/mg），P<0.05。PAS染色發(fā)現(xiàn)ADR小鼠腎小球硬化在第八周明顯增多，對

6、照組、ADR組和A+P組的硬化指數(shù)分別是0.13±0.34，1.64±1.65和0.85±1.30，P<0.0001。WT-1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ADR組小鼠腎小球足細胞數(shù)量較對照組顯著降低，第二周和第八周足細胞數(shù)分別為4.72±1.67 vs.7.89±1.77和1.64±1.86 vs.8.26±2.79，P<0.001。pCPT-cAMP可防止ADR腎病小鼠的足細胞數(shù)量減少，第2周和第8周分別為6.97±1.79和5.35±1.62（

7、和 ADR組比較，P均<0.001）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，pCPT-cAMP可顯著防止ADR誘導(dǎo)足細胞特異性蛋白synaptopodin和podocalyxin表達下降，降低足細胞損傷標志desmin的表達。相比于ADR組小鼠，pCPT-cAMP降低PCNA+PECs數(shù)量（2.75±3.23 vs1.02±2.16，ADR組 vs. A+P組，P<0.0001）。ADR腎病小鼠PECs重新表達 CD44，pCPT-cAMP顯著抑制PECs

8、CD44表達。p57/claudin1免疫熒光染色顯示，ADR小鼠腎小球中p57+claudin1+PECs較對照組明顯增多0.276±0.60 vs.0.097±0.30，P<0.05。pCPT-cAMP則使腎小球中p57+claudin1+PECs數(shù)量進一步增多0.422±0.66 vs.0.276±0.60（A+P vs. ADR,P<0.05）。
　　結(jié)論：pCPT-cAMP激活PKA信號后可以減輕ADR腎病小鼠的足細胞損