球形芽胞桿菌X050晶體蛋白的特性及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、從長沙岳麓山采集的土樣中篩選出一株芽胞桿菌，經(jīng)抗腫瘤活性檢測，結(jié)合形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA基因Blast同源序列比對(duì)分析，確定了一株含伴胞晶體且高毒力球形芽胞桿菌新菌株，命名為Lysinibacillus sphaericus X050，簡稱BsX050（保藏號(hào)CCTCC NO:M2014160）。
　　測定BsX050菌株的發(fā)酵生長曲線，收集不同生長階段的上清液，進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BsX050菌株進(jìn)入穩(wěn)定期

2、后，發(fā)酵上清液對(duì)B16細(xì)胞和HeLa細(xì)胞具有明顯的毒性。用60％的硫酸銨沉淀，粗提蛋白進(jìn)行抗腫瘤譜的測定，結(jié)果表明BsX050菌株發(fā)酵上清液對(duì)B16、4T1、Hep-3B、HT29、MCF-7和HeLa具有廣譜的抗腫瘤活性。進(jìn)一步用GE-蛋白純化儀(AKTA)和安捷倫超高效液相色譜（UHPLC）對(duì)發(fā)酵液中抗腫瘤活性物的分離純化條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。
　　提取BsX050菌株的伴胞晶體進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴胞晶體呈圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)

3、松散，致密性不好;SDS-PAGE檢測及膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定，其為Surface protein SlpC OS，分子量為125kDa。Zn2+對(duì)伴孢晶體產(chǎn)量影響的分析表明Zn2+的濃度為10-6mol/L時(shí)伴胞晶體產(chǎn)量提高，Zn2+的濃度為10-3mol/L時(shí)伴胞晶體的產(chǎn)生基本被抑制。對(duì)伴胞晶體進(jìn)行溶解性和穩(wěn)定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該伴胞晶體在pH為12.5，且不含β-巰基乙醇的50mM Na2CO3溶液中溶解出較多的晶體蛋白，胰蛋白酶與晶體蛋

4、白的體積比為1/10，在37℃放置3h后，晶體蛋白全部被酶解成晶體毒素蛋白。晶體毒素蛋白作用4T1細(xì)胞，Hep-3B細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡和掃描電鏡下觀察到4T1和Hep-3B形態(tài)發(fā)生明顯變化，而HUVEC的形態(tài)無明顯變化，采用MTT法測定晶體毒素蛋白對(duì)4T1、Hep-3B和HUVEC的細(xì)胞毒力，發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白對(duì)4T1和Hep-3B細(xì)胞毒力呈時(shí)間與濃度的依賴性，而對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖無明顯影響。激光共聚焦顯微鏡觀察到

5、晶體毒素蛋白能損傷4T1和Hep-3B的亞顯微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核皺縮變小，微管蛋白減少并向細(xì)胞核靠攏使細(xì)胞變圓，線粒體熒光強(qiáng)度減弱，而對(duì)HUVEC的亞顯微結(jié)構(gòu)無明顯的損傷，晶體毒素蛋白處理4T1和Hep-3B細(xì)胞后，提取其DNA，凝膠電泳檢測到DNA“梯狀”條帶，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白誘導(dǎo)4T1細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，westernblotting發(fā)現(xiàn)Bax蛋白及PARP剪切蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果