髓系抑制細胞(MDSC)和mTOR信號通路在哮喘發(fā)生中的作用機制研究.pdf

1、背景：MDSC(Myeloid derived suppressor cell)是髓系來源的免疫抑制細胞，在急慢性炎癥、腫瘤及重癥感染等疾病中MDSC明顯增多，且負向調(diào)節(jié)機體免疫功能。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase)/蛋白激酶B（protein kinase B）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin）/p70S6k（簡稱mTOR）信號通路，主要調(diào)控細胞

2、的生長分化，其還可改變下游效應分子的活化狀態(tài)，影響細胞凋亡、增殖、血管生成及轉(zhuǎn)化，參與核糖體合成、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細胞凋亡和生長。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)生及發(fā)展與 mTOR號通路的改變相關，其非常有希望成為治療新靶點。支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性炎癥性疾病，已經(jīng)嚴重危害了兒童的身心健康，并且70％-80%的兒童發(fā)病年齡小于5歲，如果不能及時的明確診斷并給予有效治療治，將會隨著病程的延長產(chǎn)生氣道重塑，從而失去最佳的治療時機，對孩子

3、傷害更大。MDSC及mTOR信號通路已廣泛應用于腫瘤的研究及臨床治療中，而在哮喘中的研究較少，且在哮喘發(fā)病中發(fā)病機制未明確，此外，二者是否共同在哮喘中起作用及如何作用尚未見報道。本研究分為三個部分：
　　第一部分：內(nèi)源、外源MDSC引起Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的作用及機制研究。
　　目的：探討內(nèi)源、外源MDSC與Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的分子機制。
　　方法：為了研究內(nèi)源 MDSC在哮喘發(fā)生中的作用，通過臨

4、床研究設哮喘組、干預組與對照組，ELISA檢測各組外周血清 IL-10、IL-12水平，流式細胞檢測外周血MDSC比例，并分析MDSC與 IL-10、IL-12的相關性；同時建立動物實驗模型，設哮喘組、干預組及對照組，HE、PAS染色觀察各組氣道炎癥，免疫組化染色觀察各組MDSC、IL-10及IL-12水平；為了探討外源 MDSC在哮喘中的抑制作用，建立大腸癌小鼠模型，標記并提取MDSC，注入哮喘小鼠模型中，分為對照組，哮喘組，干預組及

5、移植組，觀察各組哮喘氣道重塑的表達，檢測各組血清及BALF中IL-10及IL-12水平，分析移植組MDSC與IL-10，MDSC與IL-12的相關性。
　　結(jié)果：⑴哮喘發(fā)作組血清MDSC與IL-10水平均顯著升高，且兩者呈正相關，發(fā)作組的IL-12水平顯著下降，MDSC與IL-12呈負相關。⑵哮喘組小鼠氣道炎癥、氣道重塑顯著，肺組織MDSC及IL-10水平均顯著升高，IL-12水平顯著下降。⑶從骨髓細胞懸液中可提取較高比例的MDS

6、C，外源MDSC移植入哮喘小鼠后氣道重塑顯著改善，肺組織 MDSC及 IL-10水平顯著下降，且兩者呈正相關，IL-12水平干預后顯著上升，且與MDSC呈負相關。
　　結(jié)論：內(nèi)源MDSC增高時 IL-10升高、IL-12降低，導致Th1/Th2失衡與哮喘發(fā)生相關；外源MDSC可使IL-10降低、IL-12升高，糾正Th1/Th2失衡從而抑制哮喘。
　　第二部分：mTOR信號通路引起Th17/Treg失衡在哮喘中的作用及機制研

7、究。
　　目的：驗證mTOR信號通路是否通過誘發(fā)Th17/Treg失衡從而在哮喘發(fā)生時起誘導作用，抑制通路的各個靶點是否通過糾正Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時起抑制作用，比對不同的抑制劑應用后各個靶點水平。
　　方法：臨床研究設哮喘重度發(fā)作組、輕度發(fā)作組及緩解組、肺炎組及正常對照組，用ELISA分別測定各組血清的mTOR，IL-17及TGF-β水平；動物實驗設生理鹽水對照組、卵蛋白哮喘組、布地奈德干預組，mTOR抑制劑（

8、雷帕霉素）干預組，PI3K抑制劑（LY294002）干預組，Akt抑制劑（曲西立濱）干預組，各組分別應用HE染色、PAS染色，各組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及 p-p70S6K行免疫組織化學染色及 Western blot檢測；分別用ELISA檢測BALF及血清中的IL-17及TGF-β水平。
　　結(jié)果：⑴哮喘重度發(fā)作組較其余各組相比，血清中的mTOR及IL-17顯著升高，TGF-β顯著下降；mTOR與IL-17呈正相

9、關，與TGF-β呈負相關；其余各組之間mTOR、IL-17及TGF-β水平無顯著差別；⑵mTOR信號通路在哮喘發(fā)生時被激活，氣道重塑明顯，緩解時氣道重塑明顯改善；⑶哮喘發(fā)作時免疫組化及 Western blot檢測 p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K水平均升高，干預后各指標均顯著降低；⑷p-PI3K表達水平在曲西立濱干預組顯著高于哮喘組，哮喘組又顯著高于其余各組；p-Akt在雷帕霉素干預組顯著高于哮喘組，哮喘組又顯

10、著高于其余各組；p-mTOR及p-p70S6k的表達水平在哮喘組均顯著高于其余各組；⑸哮喘發(fā)生時小鼠BALF及血清IL-17升高、TGF-β降低，哮喘緩解時 BALF及血清IL-17降低、TGF-β升高。
　　結(jié)論：mTOR信號通路激活時可引起IL-17升高、TGF-β降低，從而導致Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時起誘導作用；相反，哮喘緩解時 mTOR信號通路被抑制，血清IL-17降低、TGF-β升高，Th17/Treg失衡被糾

11、正；通路各個靶點水平在各個靶點抑制劑應用后比對有差異。
　　第三部分：MDSC、mTOR信號通路通過iNOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用。
　　目的：驗證MDSC、mTOR信號通路是否通過iNOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用。
　　方法：設生理鹽水對照組，卵蛋白哮喘組，布地奈德干預組，檢測各組iNOSmRNA及NO表達；哮喘組小鼠p-mTOR及p-p70S6K水平在外源MDSC注入前后的變化，注入前后iNOS及NO水平

12、的變化，哮喘小鼠中用iNOS抑制劑（L-硝基精氨酸 L-nitro-arginine LNA）注入前后p-mTOR及p-p70S6K水平變化；哮喘小鼠mTOR抑制劑（雷帕霉素）應用后內(nèi)源MDSC、iNOS及NO的水平變化，用LNA注入哮喘小鼠中測定注入前后內(nèi)源 MDSC水平的變化（各組 iNOS及NO水平用ELISA檢測，各組p-mTOR及p-p70S6K用免疫組化染色及Western blot檢測）；ELISA測定哮喘組血清 mTOR

13、及iNOS水平，用免疫組化測檢肺組織中MDSC水平，pearson直線相關分析其中兩兩的相關性。
　　結(jié)果：⑴iNOS及NO水平在哮喘組顯著高于對照組、干預后顯著下降。⑵哮喘組小鼠外源MDSC注入后p-mTOR、p-p70S6K，iNOS及NO水平均較注入前下降； LNA注入哮喘小鼠后p-mTOR及p-p70S6K水平均下降。⑶雷帕霉素注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDSC水平，iNOS及NO水平均較注入前下降；LNA注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDS