PDE4和PKA基礎(chǔ)活性對豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞興奮性和收縮力的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：
　　膀胱逼尿肌的特點是可發(fā)生自發(fā)性期相性收縮，其原因為L-型電壓依賴的鈣通道(VDCC)介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流以及細(xì)胞內(nèi)鈣庫-肌漿網(wǎng)(SR)介導(dǎo)的鈣釋放。膀胱逼尿肌出現(xiàn)肌源性或者神經(jīng)源性的活性改變都可以導(dǎo)致自發(fā)性期相性收縮的增加，引起逼尿肌不穩(wěn)定(DO)的出現(xiàn)，引起相應(yīng)臨床癥狀。
　　膀胱逼尿肌收縮與膀胱逼尿肌細(xì)胞的電興奮活動密不可分，可以影響膜電位、跨膜電流、鈣內(nèi)流的因素都可以進一步影響膀胱逼尿肌的收縮活動。環(huán)磷酸腺苷(

2、cAMP)信號通路的調(diào)節(jié)在膀胱逼尿肌收縮活動中起著重要的作用。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，腺苷酸環(huán)化酶(ACs)將三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化為cAMP，而磷酸二酯酶(PDE)水解cAMP為單磷酸腺苷(AMP)。在生理狀態(tài)的細(xì)胞中，ACs和PDE達到一個動態(tài)的平衡，保證了cAMP穩(wěn)定在一定水平。蛋白激酶A(PKA)是cAMP的效應(yīng)器，是平滑肌細(xì)胞中一種十分重要的酶，它能調(diào)節(jié)SR中肌漿網(wǎng)ATP鈣泵(SERCA)、Ryanodine受體(RyRs)和大

3、電導(dǎo)電壓及鈣激活鉀(BK)通道的活性。
　　PDE可以作用于cAMP和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，以前的研究發(fā)現(xiàn)cGMP對膀胱逼尿肌細(xì)胞的興奮性并不起作用。此外，蛋白激酶G(PKG)對膀胱逼尿肌收縮性的調(diào)節(jié)作用也有爭議。PDE4特異性作用于cAMP，由四個基因(PDE4A-PDE4D)編碼了超過20個不同的剪接變異體。PDE4亞型有著器官和組織細(xì)胞類型的表達特異性，不同的PDE4亞型位于細(xì)胞內(nèi)的不同位置。進行高選擇性的PDE4亞型抑制

4、，可以激活局部的cAMP/PKA通路，調(diào)節(jié)特異性的細(xì)胞功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)的24個不同組織中，PDE4D mRNA水平在膀胱有著高表達，也高于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肌。
　　本研究從細(xì)胞和組織功能兩個層面上闡述了PDE4可以通過作用于cAMP/PKA，調(diào)控SR上RyRs“鈣火花”的釋放，進而調(diào)節(jié)TBKCs，自發(fā)性瞬時超極化(STHs)和MP，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終調(diào)節(jié)豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞的興奮性，同時控制豚鼠膀胱逼尿肌自發(fā)性期

5、相性收縮、卡巴膽堿誘發(fā)的收縮及電場刺激(EFS)誘發(fā)的收縮，以及BK通道的調(diào)節(jié)。同時闡述了無cAMP激活的情況下，PKA的基礎(chǔ)活性對于維持膀胱逼尿肌細(xì)胞興奮性及膀胱逼尿肌收縮力的重要作用，以及BK通道在其中的作用。
　　材料與方法:
　　1、逼尿肌組織標(biāo)本
　　雄性豚鼠置入CO2密閉箱中15分鐘，處死豚鼠。取出膀胱，置入0℃的解剖溶液(DS)中，保留膀胱頂至輸尿管間嵴之間的膀胱組織，移除粘膜，將膀胱逼尿肌縱行切成2～3

6、mm寬，5～7mm長的肌條。
　　2、逼尿肌細(xì)胞新鮮分離
　　將1～2枚逼尿肌離體肌條置入37℃2ml含有1mg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、1mg/ml papain和1mg/ml DL-dithiothreitol的2ml DS中12～18分鐘，然后將肌條轉(zhuǎn)移至37℃2ml含有1mg/ml BSA、0.5mg/mlⅡ型collagenase、0.5mg/ml trypsin抑制劑

7、和100μM CaCl2的DS中12～15分鐘最。然后將肌條用含有1mg/ml BSA的DS沖洗三遍后吹打肌條，得到新鮮分離的細(xì)胞懸液。
　　3、逼尿肌離體肌條的cAMP測定
　　根據(jù)cAMP酶免疫法的操作指南進行測定。將肌條放置在37℃PSS中進行孵育20分鐘，給予95％O2，5％CO2，對不同的肌條分別給予10μM Rolipram（實驗組）、10μM IBMX（陽性對照組）和生理鹽水溶液（陰性對照組）。孵育后取出肌條置

8、入液氮中，碾磨使其成為均質(zhì)的粉末后加入到0～4℃的5％三氯酸中（每毫克組織加入10ml三氯酸），離心速度≥600g，離心時間10分鐘后，提取上清液應(yīng)用3倍體積的水飽和乙醚洗滌并干燥，之后進行測定。cAMP以每毫克組織中的含量(pM/mg)進行表述，應(yīng)用ELX808Ultra Microplate Reader(BioTek，Winooski，VT)進行測定。
　　4、共聚焦顯微鏡“鈣火花”測定
　　將新鮮分離的豚鼠膀胱逼尿肌

9、細(xì)胞懸液置入底部給予poly-L-lysine的35mm圓皿中30分鐘，使細(xì)胞附著在圓皿底部，移除上清后，給予含有2μM Fluo-4-AM的細(xì)胞外液，室溫暗室孵育1小時后，應(yīng)用細(xì)胞外液清洗3次，移除Fluo-4-AM。應(yīng)用LSM700共聚焦顯微鏡63×油鏡進行檢測。488nm的氬激光作為激發(fā)光，發(fā)射光在510nm處記錄。線性掃描的記錄線設(shè)置為0.033μm/pixel，每一個循環(huán)掃描4s，速度為528lines/s，每隔1min重復(fù)掃

10、描，共掃描10次。應(yīng)用ImageJ SparkMaster插件進行分析。背景的熒光度F0為靜息狀態(tài)下的熒光度，認(rèn)定“鈣火花”的閾值設(shè)定為大于背景熒光度平均值3.8倍的標(biāo)準(zhǔn)差，“鈣火花”的振幅和頻率進行獨立分析，取每組最后5次掃描的平均值?！扳}火花”的頻率單位為sparks/100μm×s。實驗在室溫下測定(22～23℃)。
　　5、細(xì)胞內(nèi)整體鈣離子水平測定
　　將新鮮分離的細(xì)胞懸液置入底部給予poly-L-lysine的35

11、mm圓皿中30分鐘，使細(xì)胞附著在圓皿底部，移除上清后，給予含有2μM Fura-2-AM的細(xì)胞外液，室溫暗室孵育30分鐘后，應(yīng)用細(xì)胞外液清洗3次，移除Fura-2-AM。應(yīng)用OLYMPUSIX81顯微鏡40×油鏡和MetaFluor7.7.2.0進行檢測。應(yīng)用340nm和380nm波長處的光進行激發(fā)，曝光時間為15ms，曝光間隔為3秒，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平用510nm處的發(fā)射光強度的比值來表示，即F340/F380。所有試驗在室溫中進行(2

12、2～23℃)。
　　結(jié)果:
　　1、PDE4控制膀胱逼尿肌細(xì)胞的興奮性。
　　(1)PDE4對豚鼠膀胱逼尿肌cAMP水平的影響：應(yīng)用酶免疫法檢測可見選擇性PDE4抑制劑Rolipram(10μM)將cAMP從對照組0.04±0.01pmol/mg升高到1.6±0.4pmol/mg(n=5，N=5;P＜0.05)，作為陽性對照組給予非選擇性PDE抑制劑IBMX(10μM)，cAMP濃度升高到4.4±0.3pmol/mg(

13、n=5，N=5;P＜0.05對比對照組;P＜0.05對比10μM Rolipram)。
　　(2)PDE4對膀胱逼尿肌細(xì)胞內(nèi)“鈣火花”的調(diào)節(jié)：我們應(yīng)用共聚焦顯微鏡進行快速線性掃描進行“鈣火花”測定。對照組平均“鈣火花”頻率為38.2±12.1sparks/100μm×s(n=15，N=9)。選擇性PDE4抑制劑Rolipram(10μM)明顯提高豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞“鈣火花”頻率至對照組的514±152％（n=15，N=9;P＜0.

14、05），但“鈣火花”振幅沒有顯著提升，為對照組的95.3±11.6％(n=15，N=9;P＞0.05)。
　　2、PKA基礎(chǔ)活性對膀胱逼尿肌細(xì)胞興奮性和膀胱逼尿肌收縮力的影響。
　　(1)PKA基礎(chǔ)活性對豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下“鈣火花”的影響：我們應(yīng)用共聚焦顯微鏡進行快速的線性掃描進行“鈣火花”測定。PKA抑制劑H-89(10μM)降低平均鈣火花頻率從對照組71.7±29.3sparks/100μm×s(n=8，N=6

15、)至實驗組的28.1±11.6sparks/100μm×s(n=8，N=6)，降低鈣火花振幅從對照組1.4±0.5至實驗組的1.0±0.3，即降低鈣火花的頻率和振幅至對照組的58.1±13.9％和79.7±7.8％(n=8,N=6;P＜0.05;)。
　　(2)PKA基礎(chǔ)活性對豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞靜息水平TBKCs的影響：PKA抑制劑H-89(10μM)完全抑制了豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞TBKCs，在進行實驗的所有細(xì)胞均可以觀察到該作用(

16、n=10，N=10)，隨后給予PDE1抑制劑8MM-IBMX(10μM)不能提高TBKCs。另一種選擇性的PKA抑制劑PKI14-22(5μM)完全抑制了逼尿肌細(xì)胞的TBKCs(n=6，N=5)。
　　3、PDE4對豚鼠膀胱逼尿肌興奮性和收縮性的影響及BK通道在其中的作用。
　　PDE4對豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞MP的影響及BK通道在其中的作用：選擇性PED4抑制劑Rolipram(10μM)超極化豚鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞MP平均8.6

17、±2.9mV(n=8，N=6;P＜0.05對比對照組)，隨后給予BK通道抑制劑Paxilline(1μM)重新去極化MP至對照組水平(-20.6±3.5mV;n=8，N=6;P＜0.05對比rolipram組)。應(yīng)用paxilline(1μM)阻斷了膀胱逼尿肌細(xì)胞STHs，去極化MP從-28.6±2.9至-18.2±2.1mV(n=7，N=5;P＜0.05對比對照組)。在paxilline（1μM）存在的情況下，給予rolipram(1

18、0μM)后MP為-18.1±2.7mV，并無明顯改變(n=7，N=5;P＞0.05，rolipram對比paxilline)。
　　結(jié)論：
　　1、PDE4通過cAMP/PKA，調(diào)節(jié)膀胱逼尿肌細(xì)胞內(nèi)SR上RyRs“鈣火花”的釋放，調(diào)節(jié)STOCs(TBKCs)，進而調(diào)節(jié)MP以及細(xì)胞內(nèi)整體鈣水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性。
　　2、PKA(而非PKG)通過BK通道控制膀胱逼尿肌細(xì)胞興奮性和收縮力。
　　3、PDE4通過BK通道