清開(kāi)靈注射液不良反應(yīng)性質(zhì)及發(fā)生機(jī)制的初步研究.pdf

1、清開(kāi)靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、鎮(zhèn)靜安神和醒腦開(kāi)竅的功效,在臨床上使用廣泛。但隨著臨床應(yīng)用日益增多,清開(kāi)靈注射液的不良反應(yīng)報(bào)告也逐漸增加。找出清開(kāi)靈注射液中致不良反應(yīng)的主要物質(zhì),是清開(kāi)靈注射液安全使用的關(guān)鍵。
　　 目前報(bào)道的清開(kāi)靈注射液不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為用藥30 min內(nèi)即可發(fā)生藥物熱、皮膚反應(yīng)或過(guò)敏性休克,同時(shí)還可能出現(xiàn)血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的不良反應(yīng)及精神癥狀,表現(xiàn)為速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。但也有不少患者的不良反應(yīng)發(fā)生于

2、第一次用藥時(shí),即無(wú)用藥史,缺乏對(duì)機(jī)體的致敏過(guò)程,它不具備Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生條件。近年來(lái)不少學(xué)者把這類不良反應(yīng)納入類過(guò)敏反應(yīng)的范疇。類過(guò)敏反應(yīng)是非IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒、釋放大量生物活性物質(zhì),從而引起系列過(guò)敏癥狀的反應(yīng)。而引起類過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的途徑有兩條,一是直接刺激肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒,二是通過(guò)經(jīng)典途徑和旁路途經(jīng)激活補(bǔ)體,使過(guò)敏毒素C3a和C5a增多,刺激肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒。
　　 因此,確定清開(kāi)靈注射液在臨床引

3、發(fā)的不良反應(yīng)性質(zhì)及其發(fā)生機(jī)制是找出致不良反應(yīng)主要物質(zhì)的首要條件。本論文從藥物毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)著手,結(jié)合體外肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)和體外補(bǔ)體激活的測(cè)定進(jìn)行研究,為清開(kāi)靈注射液不良反應(yīng)的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1、初步判斷清開(kāi)靈注射液在臨床上引發(fā)的不良反應(yīng)性質(zhì)類型,主要區(qū)分毒性反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)和類過(guò)敏反應(yīng)。
　　 2、初步研究清開(kāi)靈注射液在臨床上引發(fā)的不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制,主要判斷與補(bǔ)體系統(tǒng)激活的關(guān)系。
　　

4、 方法:
　　 1、單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)(1)血常規(guī)檢測(cè)和組織病理學(xué)檢查:昆明小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別通過(guò)尾靜脈注射的方式給予藥物,即相當(dāng)于清開(kāi)靈注射液人臨床最大給藥劑量的1、5、10、15倍四個(gè)不同劑量的藥液和生理鹽水。給藥前均禁食不禁水12 h,給藥后正常飼養(yǎng)14 d。試驗(yàn)期間觀察指標(biāo)包括動(dòng)物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)等。對(duì)瀕死及死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖,其他動(dòng)物在觀察期結(jié)束后抽樣采血

5、進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)(計(jì)數(shù)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板,測(cè)定血紅蛋白),采用One—Way ANOVA方法比較組間各指標(biāo)是否有差異。同時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行解剖,當(dāng)發(fā)現(xiàn)器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時(shí),則對(duì)改變的器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。(2)血清電解質(zhì)檢測(cè):Wistar大鼠隨機(jī)分為藥液組(10倍劑量清開(kāi)靈注射液)和生理鹽水對(duì)照組,每組8只。給藥前禁食不進(jìn)水12 h,通過(guò)腹腔注射給藥,給藥5 min后水合氯醛麻醉,斷頭采血進(jìn)行血清電解質(zhì)檢測(cè)(K+、Na+、Ca

6、2+含量)。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),比較兩組間各指標(biāo)是否有差異。
　　 2、體外溶血實(shí)驗(yàn)(1)體外溶血:按照藥典相關(guān)內(nèi)容,用新鮮兔血配制2％紅細(xì)胞懸液,利用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)血紅素的吸光值,通過(guò)計(jì)算分別考察不同批號(hào)的清開(kāi)靈注射液、不同自制和廠家來(lái)源的拆方組分藥液的體外溶血作用,每藥液組設(shè)立1、5、10、15倍四個(gè)濃度。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異,不同濃度下的組間多重比較用LSD方法。(2)多次給藥后

7、體外溶血:Balb/C小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組6只,分別腹腔注射5倍劑量的清開(kāi)靈注射液和生理鹽水,隔日1次,共3次。于首次給藥后的第15 d,斷頭采血,分別制備2％紅細(xì)胞懸液,考察不同濃度的清開(kāi)靈注射液對(duì)其溶血作用。采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異。
　　 3、肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)(1)以PBS為空白對(duì)照,在不同濃度清開(kāi)靈注射液與RBL-2H3細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后,通過(guò)MTT方法考察藥液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。(2

8、)不同藥液分別與RBL-2H3細(xì)胞共孵育45min后,吸取上清,通過(guò)對(duì)其中過(guò)敏活性物質(zhì)組胺的釋放量或者β-氨基己糖苷酶的凈釋放度的計(jì)算,考察不同濃度、不同批號(hào)的清開(kāi)靈注射液以及不同自制和廠家來(lái)源的拆方組分藥液對(duì)肥大細(xì)胞的脫顆粒作用,以Tyrode’s液為陰性對(duì)照,采用One—Way ANOVA方法,比較不同組別間是否有差異。
　　 4、體外血清補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)人血清分別與PBS、清開(kāi)靈注射液與在體外共孵育,通過(guò)檢測(cè)血清補(bǔ)體系統(tǒng)激活最

9、終產(chǎn)物SC5b-9的含量,考察藥液對(duì)血清補(bǔ)體激活的作用,采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),比較PBS、清開(kāi)靈注射液兩組間是否有差異。同時(shí)考察不同孵育濃度和時(shí)間的影響,采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析比較主效應(yīng)組間是否有差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)在給藥后很短時(shí)間內(nèi),隨藥物劑量增加,小鼠出現(xiàn)乏力、抽搐、昏迷甚至死亡的不同反應(yīng)；與生理鹽水空白組比較,15倍劑量組小鼠在血常規(guī)檢測(cè)中紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量有顯著性差異,小于空白

10、組(F=10.973,P=0.008；F=9.445,P=0.011)；在病理切片中顯示肺部充血明顯；用藥組小鼠血清電解質(zhì)(K+、Na+、Ca2+)含量與生理鹽水對(duì)照組無(wú)顯著性差異(t=0.404,P=0.692；t=-0.352,P=0.730；t=-0.803,P=0.436)。
　　 2、體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)合觀察結(jié)果以及通過(guò)吸光值計(jì)算的結(jié)果來(lái)看,自制拆方組分金銀花、梔子以及藥廠來(lái)源拆方組分水牛角&珍珠母的混合提取液具有溶血作用

11、,藥廠來(lái)源拆方組分黃芩苷以及兩種來(lái)源的金銀花、梔子、珍珠母和板藍(lán)根在較大濃度的時(shí)候(5倍及以上)均能引起紅細(xì)胞的凝集。不同批號(hào)的清開(kāi)靈注射液中,在較大濃度(10倍及以上)時(shí),除批號(hào)為812903A、811704A的藥液外(兩者來(lái)自同一個(gè)藥廠),其他批號(hào)的都能引起溶血；批號(hào)為811704A和070702的注射液能引起輕度凝集。清開(kāi)靈注射液在體外對(duì)多次給藥的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組Balb/C小鼠的溶血度無(wú)顯著性差異(F=0.022,P=0.882)

12、。
　　 3、肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)在對(duì)RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響上,各清開(kāi)靈組、PBS空白組間有顯著性差異(F=593.247,P=0.000)。其中清開(kāi)靈注射液濃度在1/960～2/15(V/V))之間時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用,而濃度高于2/15(V/V))時(shí)則抑制其生長(zhǎng)。與Tyrode’s液陰性組比較,不同濃度的清開(kāi)靈注射液對(duì)RBL-2H3細(xì)胞組胺釋放量和β-氨基己糖苷酶凈釋放度有顯著性差異、不同批號(hào)的清開(kāi)靈注射液對(duì)β-氨基己糖苷酶

13、釋放度有顯著性差異(P<0.05),表現(xiàn)為促進(jìn)作用。但僅2/9個(gè)批號(hào)的促進(jìn)釋放作用強(qiáng)于陽(yáng)性組。清開(kāi)靈注射液自制拆方組分(濃度均為1/10(V/V))除珍珠母外,對(duì)RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶凈釋放均具有促進(jìn)作用,其中金銀花促釋放作用最強(qiáng)(F=17024.728,P=0.000)。清開(kāi)靈注射液藥廠來(lái)源拆方組分(濃度均為1/10(V/V))對(duì)RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶凈釋放均具有促進(jìn)作用,其中金銀花和梔子促釋放作用最強(qiáng)(F=2

14、517.163,P=0.000)。
　　 4、體外血清補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)與PBS緩沖液相比,清開(kāi)靈注射液和人血清1/1(V/V)在體外振蕩孵育30min后,血清補(bǔ)體末端復(fù)合物SC5b-9的含量有顯著性差異,但清開(kāi)靈組的含量低于PBS藥液組(t=2.897,P=0018)。同時(shí)不同孵育濃度、不同孵育時(shí)間組間比較F=3.436,P=0.066;F=1.97,P=0.182。
　　 結(jié)論:清開(kāi)靈注射液在臨床上的不良反應(yīng),不能簡(jiǎn)單歸于