附子毒動學及烏頭堿吸收與代謝特征研究.pdf

1、目的和意義:附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx)的子根加工品,是中醫(yī)臨床上治療風濕性和心血管性疾病的常用中藥,具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用。但在臨床上出現(xiàn)了較多的不良反應和中毒事件,盡管經(jīng)過炮制已降低了附子的毒性,但仍使其應用受到極大限制。文獻報道,附子的治療劑量與中毒劑量非常接近,這與其所含的烏頭類二萜生物堿具有較強毒性有關(guān),其中以烏頭堿最具有代表性。因此,在研究附子毒代動力學特征時,可選擇烏頭

2、堿作為附子的特征性標志物,從烏頭堿的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等方面探求附子的體內(nèi)特征及機理可為附子的毒性監(jiān)控提供依據(jù)。本論文以烏頭堿為特征性標志物,研究了烏頭堿及附子醇提物單次和多次給藥時烏頭堿的毒動學特征,并闡明了烏頭堿的吸收和代謝機理,為附子的毒性預警和臨床應用提供依據(jù)。
　　 方法
　　 一.附子提取物和烏頭堿毒代動力學研究
　　 1.附子代表性毒性成分烏頭生物堿類的安全窗評價研究采用小鼠急性毒性

3、實驗,觀察口服灌胃烏頭類生物堿(烏頭堿,中烏頭堿及次烏頭堿)后小鼠一般狀況及其死亡率,計算出其LD50及其95％可信限；采用醋酸扭體鎮(zhèn)痛模型,觀察小鼠在不同濃度劑量組以及陰性、陽性對照組小鼠的扭體次數(shù),計算其疼痛抑制率。通過其死亡率和疼痛抑制率得到烏頭類生物堿的量效反應雙曲線。
　　 2.附子代表性毒性成分烏頭堿的毒代動力學特征研究由于臨床上附子主要用于治療心動過緩性心律不齊等慢性病,這增大了其產(chǎn)生毒性反應的可能性,因此評價附子

4、的毒性,不僅要研究附子單次給藥毒代動力學特征,對其長期給藥的毒代動力學特征進行評價也是非常有必要的。在本課題的研究中,我們不僅完成了烏頭堿單次和長期毒動學實驗,還對文獻從沒報道過的附子提取物的單次和多次給藥毒動學特征進行了比較。為此,我們建立了一種靈敏可靠的UPLC/MS/MS方法來測定血漿中烏頭堿的含量,確保結(jié)果準確可靠。在此條件下進行專屬性考察、線性范圍考察、精密度實驗、準確度實驗、回收率實驗等一系列方法學考察。
　　 采用

5、大鼠后眼眶取血的方法分別完成大鼠烏頭堿靜脈注射毒代動力學實驗、烏頭堿長期口服毒代動力學實驗、口服附子醇提物的單次和長期毒代動力學實驗、口服附子總生物堿毒代動力學實驗,經(jīng)3P97藥動學軟件處理,計算其毒代動力學參數(shù)。
　　 3.烏頭堿血漿蛋白結(jié)合率的測定盡管烏頭堿的藥理作用和生物利用度測定已經(jīng)有人報道,但其血漿蛋白結(jié)合率特征至今鮮有文獻報道。因此,本課題選用平衡透析法測定了烏頭堿的血漿蛋白結(jié)合率,這不僅利于闡明烏頭堿的藥效學性質(zhì),

6、同時,對附子的生物活性特征也能產(chǎn)生更深刻的理解。
　　 二.烏頭堿體內(nèi)吸收特征研究采用大鼠在體腸灌流模型,測定烏頭堿在大鼠各個腸段的吸收率,研究烏頭堿體內(nèi)吸收特征。
　　 三.烏頭堿代謝特征研究文獻報道在大鼠體內(nèi)烏頭堿主要產(chǎn)生6種代謝產(chǎn)物,主要通過肝微粒體中細胞色素P450來催化完成。但對于烏頭堿在人體內(nèi)的CYP代謝途徑及產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的CYP同工酶未見報道。由于人體中90％的藥物是通過七種主要的CYP同工酶(CYP1A2

7、、2C9、2C8、2C19、2D6、2E1和3A4/5)代謝,因此我們運用UPLC/MS/MS測定了重組人細胞色素P450酶對烏頭堿的代謝,建立烏頭堿CYP同工酶代謝特征譜,為烏頭堿和附子的毒性預警和臨床應用提供依據(jù)。
　　 結(jié)果
　　 1.小鼠口服給藥烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的LD50分別為3.17 mg/kg、2.11mg/kg和3.11 mg/kg；三種烏頭類生物堿的安全范圍都很狹窄,中烏頭堿和次烏頭堿的ED95

8、均大于LD5。。
　　 3.大鼠靜脈注射烏頭堿(40μg/kg)后其主要毒代動力學參數(shù):消除半衰期T1/2為80.98±6.40min,曲線下峰面積AUC(0-∞)為3201.89±338.91 ng·min·ml-1,烏頭堿在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度為8.31±0.89％。
　　 4.附子醇提物大鼠口服單次給藥和長期給藥的主要毒代動力學參數(shù)AUC(0-∞)、MRT(0-∞)、CL、K、T1/2和Cmax無顯著性差異(P

9、>0.05),Tmax具有顯著性差異(P<0.05)。大鼠單次口服附子醇提物后,烏頭堿絕對生物利用度為4.72±2.66％。附子總生物堿大鼠口服單次給藥后,烏頭堿絕對生物利用度為5.79±0.82％,與附子醇提物單次給藥后烏頭堿絕對生物利用度相比,無顯著性差異。
　　 5.大鼠口服烏頭堿長期給藥主要毒代動力學參數(shù)AUC(0-∞)、CL、T1/2、Cmax和Tmax與大鼠單次口服同劑量烏頭堿毒代動力學參數(shù)相比,均無顯著性差異(P>

10、0.05)。
　　 6.在5、20、50 ng·ml-1三個質(zhì)量濃度的烏頭堿血漿蛋白結(jié)合率分別為31.90％±1.69％、27.4％±1.71％和23.9％±2.51％。
　　 7.烏頭堿在大鼠各腸段的吸收率分別為十二指腸29.18±8.64％、空腸22.60±3.00％、回腸25.03±6.97％、結(jié)腸15.02±2.75％,滲透率分別為十二指腸1.30±0.38、空腸1.01±0.13、回腸1.11±0.31、結(jié)腸0

11、.67±0.12。
　　 8.P450同工酶是參與烏頭堿代謝的主要酶蛋白,其中M1由CYP2D6、2C8、3A4、3A5代謝產(chǎn)生,M2及M3由CYP2D6、2C9、3A4、3A5代謝產(chǎn)生,M4及M6由CYP2D6和CYP3A5產(chǎn)生,M5由CYP3A4和CYP3A5產(chǎn)生。
　　 結(jié)論
　　 1.烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿在小鼠體內(nèi)均能產(chǎn)生產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛作用,但其半數(shù)致死量LD50值均較低,毒性較大,限制了其使用。<

12、br>　　 2.研究表明烏頭堿給藥、附子醇提物單次給藥和附子總生物堿單次給藥后按烏頭堿計算,其在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度(F)分別為8.31±0.89％、4.72±2.66％和5.79±0.82％,顯示烏頭堿在大鼠體內(nèi)生物利用度較低。烏頭堿單次給藥與多次給藥后毒動學參數(shù)無顯著性差異說明烏頭堿在大鼠體內(nèi)代謝較快,經(jīng)過24h(約7個半衰期,ⅳ),烏頭堿在體內(nèi)殘留極少,無蓄積現(xiàn)象。大鼠附子醇提物單次或多次給藥后,AUC(0-∞)、MRT(0

13、-∞)、CL、K、T1/2和Cmax均無顯著性差異(P>0.05),而達峰時間 Tmax具有顯著性差異(P<0.05),可能與附子醇提物中所含其它成分在吸收時的相互作用有關(guān)。烏頭堿為低血漿蛋白結(jié)合率藥物,且濃度依賴性并不明顯,從結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化耗時較少,主要以游離形式存在。
　　 3.烏頭堿在大鼠各腸段吸收量無差別,在15.02％至29.18％之間。烏頭堿在大鼠4段不同腸段的滲透率均較低,且無腸道差異,猜測可能原因為烏頭堿在腸