Gbx2維持及誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞na-ve多能性的分子機(jī)制探究.pdf

1、小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse Embryonic Stem Cells，mESCs)是分離自著床前囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞(Inner cell mass，ICM)，在體外培養(yǎng)具有無限自我復(fù)制式增殖的能力，簡稱自我更新(Self-renewal)，以及多向分化的潛能，簡稱多能性(Pluripotency)。小鼠的ESCs注射到囊胚中具有形成嵌合體動物的能力，這種發(fā)育狀態(tài)稱為Na(i)ve或者Ground多能性狀態(tài)。而小鼠的上胚層干細(xì)胞(mou

2、se Epiblast Stem Cells，mEpiSCs)與人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)在注射到囊胚后不能形成完整的嵌合胚胎。hESCs和mEpiSCs的這種相似的發(fā)育狀態(tài)稱為Primed多能性狀態(tài)。小鼠和人的ESCs需要不同的培養(yǎng)條件來維持其多能性狀態(tài)。通過在培養(yǎng)體系中加入相應(yīng)地小因子、生長因子或細(xì)胞因子來激活或抑制細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而能夠維持ESC的自我更新和多能性。

3、　　無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中加入血清(serum)和細(xì)胞因子LIF(Leukemia Inhibitory Factor)可以在體外長期維持mESCs的自我更新和多能性。LIF作為胞外信號，主要通過激活細(xì)胞內(nèi)的JAK(Janus kinase)/STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3)信號通路，從而激活下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來維持mESCs的Naive多能性狀態(tài)。一些LIF

4、/STAT3信號通路的下游靶基因己被篩選并鑒定出來，例如Gbx2，Klf4，Sps和5和Tfcp2l1等。然而，這些基因在促進(jìn)mESC自我更新方面的機(jī)制仍不清楚。
　　轉(zhuǎn)錄因子Gbx2(Gastrulation brain homeobox2)，即原腸胚形成和腦特異性同源蛋白框2，被證明是LIF/STAT3信號通路的直接下游靶基因。過表達(dá)Gbx2的小鼠胚胎干細(xì)胞能夠在無LIF的血清培養(yǎng)基質(zhì)中長期維持自我更新和多能性;并且過表達(dá)Gb

5、x2還能夠促進(jìn)mEpiSCs重編程為類似于小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCS-like)的Na(i)fve多能性狀態(tài)。但是，關(guān)于過表達(dá)的Gbx2如何替代LIF維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的分子機(jī)制，目前在國內(nèi)外并未有相關(guān)報道。也就是說，LIF/STAT3信號通路中，Gbx2激活哪些關(guān)鍵的下游基因來發(fā)揮作用呢？為探究該問題，本課題首先進(jìn)行了Gbx2靶基因的篩選和鑒定。利用PiggyBac(PB)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的方法，在46C小鼠胚胎干細(xì)胞中過表達(dá)

6、Gbx2(PB-Gbx2)，對照組轉(zhuǎn)染PB空載體，然后通過RNA-Seq結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法對Gbx2候選靶基因進(jìn)行初步篩選，包括顯著性基因表達(dá)聚類分析、GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析干細(xì)胞多能性信號通路相關(guān)的基因。qRT-PCR初步驗(yàn)證結(jié)果顯示，相比于對照組PB mESCs，PB-Gbx2mESCs中Klf4，Nanog的m

7、RNA表達(dá)水平增加了約2.0fold以上。為了進(jìn)一步探宄Gbx2對Nanog和Klf4表達(dá)的調(diào)控作用，我們從以下三個方面入手。首先，正常LIF/serum培養(yǎng)PB和PB-Gbx2mESCs，撤掉LIF1h到24h，熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)的Gbx2能夠抑制LIF的撤除所導(dǎo)致的Klf4下調(diào)，卻不能抑制Nanog下調(diào)。其次，加入4-OHT(4-hydroxytamoxifen)誘導(dǎo)Gbx2-ERT2mESCs中G

8、bx2的激活，qRT-PCR結(jié)果顯示:隨著4-OHT加入時間的增加(0-120minutes)，Klf4的表達(dá)也明顯上調(diào)，而Nanog的表達(dá)無明顯趨勢。最后，在mESCs中下調(diào)Gbx2的表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示只有Klf4的表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明，Klf4是Gbx2調(diào)控的下游基因。為了進(jìn)一步證明Klf4是否為Gbx2直接調(diào)控的靶基因，本課題從JASPAR核心數(shù)據(jù)庫(the JASPAR CORE database)在線分析和預(yù)測

9、Gbx2在Klf4啟動予(Promoter)上的結(jié)合位點(diǎn)(binding motifs)。之后通過對PB-Gbx246C mESCs進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)并檢測Klf4啟動子序列所控制且由Gbx2所激活的熒光素酶的活性，數(shù)據(jù)證明了Klf4是Gbx2的直接靶基因。
　　以上結(jié)果驗(yàn)證了Klf4是Gbx2的直接靶基因，那么Gbx2在功能上是否依賴靶基因Klf4的表達(dá)呢？因此，本課題后期主要針對靶基因Klf4對Gbx2促進(jìn)自我更

10、新和重編程功能兩方面的影響進(jìn)行探究。該部分研究結(jié)果如下:1.堿性磷酸酶染色及多能性標(biāo)志基因NANOG蛋白的免疫熒光染色等數(shù)據(jù)顯示，在過表達(dá)Gbx2的小鼠46C胚胎干細(xì)胞中將Klf4的表達(dá)敲低，Gbx2的過表達(dá)維持mESC自我更新和多能性的功能顯著降低，即:靶基因Klf4介導(dǎo)了Gbx2的促自我更新效應(yīng)。2.在CD1mEpiSCs中過表達(dá)Gbx2，并knockdown靶基因Klf4的表達(dá)，與對照組相比，該細(xì)胞克隆出現(xiàn)明顯的死亡或分化。因此，

11、Klf4的下調(diào)消除了Gbx2促進(jìn)mEpiScs重編程的效應(yīng)。由此我們得出結(jié)論:對于Gbx2促進(jìn)mEpiSCs重編程為Na(i)ve多能性狀態(tài)效率的能力，靶基因Klf4也是至關(guān)重要的。
　　綜上所述，本課題揭示了LIF/STAT3信號通路中轉(zhuǎn)錄因子Gbx2維持和誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞Na(i)ve多能性狀態(tài)的分子機(jī)制:Gbx2直接調(diào)控靶基因Klf4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新以及促進(jìn)小鼠上胚層干細(xì)胞重編程到類似小鼠胚胎干細(xì)胞