STA-2介導的秀麗隱桿線蟲表皮細胞結構破壞引發(fā)的固有免疫應答.pdf

1、表皮細胞層作為一道物理屏障經常遭受各種破壞其結構的物理損傷。但是表皮細胞免疫系統(tǒng)是否能夠將結構的破壞作為一種危險信號來激發(fā)免疫應答還不清楚。由于哺乳動物表皮細胞層結構復雜，包含多種免疫細胞的干擾。而模式生物秀麗隱桿線蟲表皮細胞層結構簡單，主要由一個單層巨大多核上皮細胞組成，是研究表皮細胞自身免疫功能的完美模型。所以我們利用線蟲表皮上皮細胞為模型來研究這一科學問題。線蟲表皮細胞在遭到穿透性感染或者機械損傷后會激發(fā)表皮細胞免疫防御引起抗菌肽

2、的表達釋放。通過系統(tǒng)性的敲除線蟲表皮細胞各支撐結構組成蛋白，我們發(fā)現(xiàn)只有頂部半橋粒的破壞能夠顯著的激發(fā)表皮細胞固有免疫應答，引起抗菌肽的轉錄上調。線蟲表皮細胞通過半橋粒頂部蛋白MUP-4以及粘附在其上的 STAT家族蛋白 STA-2來識別結構破壞。當表皮細胞嚴重受損致使頂部半橋粒解體時，STA-2便會從頂部半橋粒上脫落引發(fā)下游抗菌肽的轉錄上調。這樣的免疫應答機制使得表皮細胞在遭受大規(guī)模結構破壞時可以直接啟動抗菌肽的表達而不需要通過一步步

3、的信號傳導過程。同時我們利用人類表皮角質層細胞將在線蟲表皮細胞中的發(fā)現(xiàn)延伸到了哺乳動物細胞中。我們的研究揭示了一種進化上保守的上皮細胞識別危險以及激活免疫應答的分子機制。下面從實驗目的、方法、結果、結論和關鍵詞幾方面來簡要總結我們的研究內容。
　　目的：
　　1.尋找能夠引起線蟲表皮細胞固有免疫應答的結構原件。
　　2.闡述結構破壞引起的線蟲表皮細胞免疫應答的分子機制。
　　3.探討頂部半橋粒解體引發(fā)的線蟲表皮細

4、胞固有免疫應答的生理意義。
　　4.檢測我們在線蟲中的發(fā)現(xiàn)是否同樣存在于哺乳動物細胞中。
　　方法：
　　1，a)利用免疫熒光染色來詳細記錄秀麗線蟲晚期幼蟲負責維持表皮細胞形態(tài)結構穩(wěn)定的各類支撐結構。b)利用RNAi或者藥物處理的方法來敲降表皮細胞各結構蛋白，檢測對抗菌肽上調的影響。
　　2，a)利用RNAi和蛋白功能缺失的突變體蟲株來逐個檢測半橋粒成分缺失后線蟲表皮細胞固有免疫應答的激發(fā)情況。b)利用線蟲表皮細

5、胞調控固有免疫應答的各個信號通路成分的突變體蟲株來查找介導頂部半橋粒解體引起的固有免疫應答的信號通路。c)利用STAT家族蛋白STA-2和半橋粒成員的免疫熒光雙染觀測內源STA-2在線蟲表皮細胞的亞細胞定位以及STA-2和半橋粒的空間位置關系；同時利用免疫共沉淀技術檢測STA-2和半橋粒頂部蛋白MUP-4是否屬于同一個蛋白復合體，MUP-4是線蟲表皮細胞結構破壞引發(fā)固有免疫應答中的一個關鍵蛋白。
　　3，a)我們發(fā)展了一種使用單層

6、微米級的玻璃碎片的損傷新方法，這種方法可以一次在多條線蟲表皮層造成多個傷口。b)對野生型、p38MAPK信號通路和STA-2的突變體蟲株中各自進行兩種方法的損傷，以此來檢測表皮細胞多個傷口和單個傷口引起的免疫應答途徑是否有所不同。
　　4，a)我們在體外培養(yǎng)的成年人類表皮角質層細胞里檢測了五種支撐結構破壞后三種抗菌肽和三種細胞因子的表達。b)利用siRNA和抑制劑的方法分別檢測了哺乳動物中7個STAT轉錄因子、p38MAPK和NF

7、-kB這兩條信號通路在表皮細胞結構破壞引發(fā)的固有免疫應答的參與情況。
　　結果：
　　1，a)免疫熒光雙染結果顯示線蟲表皮細胞大多數(shù)支撐結構排列有序，彼此之間很少交聯(lián)。b)通過觀察表皮細胞免疫應答標志基因 nlp-29啟動子控制的 GFP表達變化，發(fā)現(xiàn)大部分幫助支撐表皮細胞的結構缺失后并不會引起表皮細胞抗菌肽轉錄上調。只有半橋粒頂膜受體mup-4和外皮膠原蛋白bli-1的敲除引發(fā)了顯著的抗菌肽轉錄上調。半橋粒核心蛋白vab-

8、10a和中間纖維ifb-1的敲除也引發(fā)了適量抗菌肽轉錄上調。
　　2，a)和半橋粒的頂膜受體mup-4相比，其它半橋粒成分的缺失并未顯著上調表皮細胞抗菌肽。b)線蟲表皮細胞調控免疫應答的各個信號通路成分的突變體蟲株都不能阻斷頂部半橋粒解體引起的抗菌肽上調，只有一個STAT家族蛋白STA-2的突變體可以阻斷這一免疫應答。c)免疫熒光染色結果顯示STA-2在表皮細胞里呈現(xiàn)出經典的半橋粒樣的條帶并且 STA-2和半橋粒共定位在一起；免疫

9、共沉淀結果表明MUP-4和STA-2在線蟲表皮細胞中是以同一個蛋白復合體的形式存在。
　　3，a)通過對鬼筆環(huán)肽標記傷口照片的觀察發(fā)現(xiàn)，相比舊方法，玻璃碎片的損傷方法確實可以給線蟲表皮細胞一次造成多個傷口。b)表皮細胞單一傷口激發(fā)的免疫應答需要經由p38MAPK信號通路和STA-2，但多個傷口引發(fā)的免疫應答不再通過p38MAPK信號級聯(lián)，只有STA-2的功能是必需的。
　　4，a)人類表皮角質層細胞中肌動蛋白（微絲）、微管、

10、角蛋白（中間纖維）和黏著斑這四種細胞支撐結構破壞并不會激發(fā)顯著的固有免疫應答，只有半橋粒蛋白復合體的破壞會激發(fā)顯著的固有免疫應答。b)七個 STAT中只有STAT3和 STAT5B可以減弱由半橋粒蛋白復合體破壞引發(fā)的固有免疫應答；p38 MAPK和NF-kB這兩條信號通路并不參與調節(jié)半橋粒蛋白復合體破壞引發(fā)的固有免疫應答。
　　結論：
　　1.線蟲表皮細胞大部分支撐結構的空間構架具有高度規(guī)律性并區(qū)域分明。
　　2.能夠

11、引發(fā)線蟲表皮細胞固有免疫應答的支撐結構具有空間特異性，聚集在頂部半橋粒附近。
　　3.半橋粒頂膜受體 MUP-4是介導表皮細胞結構破壞引發(fā)的固有免疫應答的關鍵蛋白。
　　4.半橋粒破壞引發(fā)的固有免疫應答需要STAT家族蛋白STA-2，但是不需要表皮細胞其它的免疫相關信號通路。
　　5. STA-2和半橋粒共定位于線蟲表皮細胞的頂膜。
　　6.線蟲表皮細胞大規(guī)模損傷激發(fā)的固有免疫應答會繞過p38 MAPK信號通路而