紅樹林免疫增強真菌的篩選及菌株PH0016的鑒定.pdf

1、目的：
　　 從海南紅樹林土壤層中分離和篩選具有免疫增強活性的真菌菌株,以多種免疫學檢測方法評價其活性,并通過形態(tài)學和分子生物學手段鑒定其種屬構成,探討紅樹林真菌在免疫調節(jié)方面的應用價值。
　　 方法：
　　 用海水馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基對采集自紅樹林5～20cm土層的真菌菌株進行分離及純化培養(yǎng),通過四氮唑藍(MTT)法對其發(fā)酵上清進行免疫增強活性的篩選。對于具有免疫增強活性的菌株,進一步通過動物體內實驗進

2、行免疫學功能的評價。隨機將KM小鼠分為實驗組和對照組,分別給予真菌發(fā)酵上清物和生理鹽水灌胃10d后再進行試驗,檢測項目包括小鼠免疫器官指數、溶血素測定、溶血空斑形成試驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)、巨噬細胞吞噬功能等。通過對菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察,結合分子生物學方法進行rDNA ITS序列的測定及同源性分析,通過BLAST比對以及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定其種屬分類地位。
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據均用均數

3、±標準差((X)±S)表示。對不同組別的測試結果進行單因素方差分析和組間的兩兩比較(SNK法),對小鼠灌胃前后的體重采用協(xié)方差分析,組間比較采用兩樣本的t檢驗,上述分析均采用雙側檢驗,檢驗水平為0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 一、紅樹林真菌的分離及免疫增強菌株的篩選結果
　　 1.菌株分離結果:從東寨港紅樹林國家自然保護區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌325株。
　　 2.MTT

4、法篩選活性菌株:用325株真菌的發(fā)酵上清對人外周血單個核細胞(PBMC)進行增殖刺激實驗,分別以PHA和基礎培養(yǎng)液作為陽性對照和陰性對照。結果發(fā)現有12株具有促進增殖作用,其中菌株P0016有較強效果。菌株P0016和陽性對照組與陰性對照組差異有顯著性意義(F=408.741,P=0.000),兩兩比較結果菌株PH0016發(fā)酵上清對人外周血淋巴細胞的增殖刺激作用顯著強于陰性對照組(P=0.000),而與陽性對照組比較無統(tǒng)計學差異(P=0

5、.073)。
　　 二、菌株PH0016的免疫增強活性評價
　　 1.PH0016活性效應產物的粗提和檢測:通過葡聚糖凝膠SephadexG-25柱層析法對菌株PH0016的發(fā)酵上清進行粗提,共分離獲得20管提取物,再次以MTT法進行免疫活性的檢測,其中第6管的作用最強,與陰性對照組的差異有顯著性意義(P=0.000),與陽性對照組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.135)。之后的KM小鼠體內試驗均以第6管提取物為樣品進行。

6、r>　　 2.PH0016提取物對小鼠生長狀況和體重及臟器比值的影響:對小鼠灌胃前后的體重采用兩樣本的t檢驗及協(xié)方差分析證實,灌胃前實驗組小鼠的體重與對照組間比較無顯著性的差異(t=0.998,P=0.332),灌胃后兩組小鼠的體重亦無顯著性差異(F=1.037,P=0.324),說明發(fā)酵上清的提取物對小鼠體重增長無影響。灌胃后實驗組小鼠的脾臟/體重比值與對照組比較無顯著性差異(t=1.878,P=0.078),說明發(fā)酵上清的提取物對

7、小鼠的脾臟/體重比值無影響。
　　 3.PH0016提取物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響:兩樣本的t檢驗分析結果顯示,經灌服發(fā)酵上清凍干劑的小鼠足跖腫脹度明顯高于對照組,差異具有顯著性(t=3.858,P=0.001)。
　　 4.PH0016提取物對小鼠體液免疫功能的影響:兩樣本的t檢驗分析結果顯示,PH0016提取物能明顯增強實驗組小鼠的HC50,實驗組與對照組比較差異具有顯著性(t=5.632,P=0.000

8、)；其PFC水平與對照組比較,差異也具有顯著性(t=2.855,P=0.008)。
　　 5.PH0016提取物對巨噬細胞吞噬功能的影響:鏡下觀察計數吞噬細胞吞噬情況時可見實驗組巨噬細胞內的雞紅細胞較多,經統(tǒng)計學分析顯示,實驗組的吞噬指數顯著高于對照組(t=3.268,P=0.003)。
　　 三、菌株PH0016的鑒定
　　 菌株在PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基3種固體培養(yǎng)基上均生長良好,在查氏培養(yǎng)基和P

9、DA培養(yǎng)基生長7d左右直徑可達15 mm～18mm。菌落扁平、質地疏松、粉絮狀、淡紫色。表面深紫色為產孢層,產孢旺盛,肉眼可見紫色孢子密集。菌落邊緣質地疏松,呈白色。菌落背面顏色呈白色。光學顯微鏡下,營養(yǎng)菌絲壁光滑,無色透明。分生孢子梗光滑無色,單個小梗直立于營養(yǎng)菌絲上,瓶?；颗虼?孢梗上具2～4個瓶梗狀的輪生分枝。頂部錐形變細,形成一薄的獨特的頸,分生孢子成向兩側分開的鏈狀,有時纏在一起,分生孢子呈卵形或近球形,成熟后表面粗糙,透明

10、無色,成團時呈紫色。以上特征與半知菌類(Fungi Imperfecti),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),瓶梗青霉屬(Paecilomyces Bainier)的分類特征相似。通過rDNA ITS序列分析和同源性檢索發(fā)現,菌株PH0016與擬青霉屬相似性均為100％。因此,可以推斷菌株PH0016的有性世代為子囊菌綱(Ascomycetes)；肉座菌目(Hypocrealesl)；麥角菌科(Cla

11、vicipitaceae)；擬青霉屬(Paecilomyces)。
　　 結論：
　　 1.紅樹林土層中真菌資源豐富,本研究自東寨港紅樹林國家自然保護區(qū)土壤樣本中共分離得到真菌325株。其中12株具有免疫增強作用。
　　 2.針對菌株PH0016的免疫學檢測研究顯示,其活性成分提取物對小鼠的T、B淋巴細胞和吞噬細胞的功能都具有明顯的增強作用。
　　 3.經形態(tài)學和分子生物學鑒定手段,結合系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構

12、建,表明該菌屬于半知菌類(Fungi Imperfecti),叢梗孢目(Moniliales),叢梗孢科(Moniliaceae),瓶梗青霉屬(Paecilomyces Bainier)；有性世代為子囊菌綱(Ascomycetes)；肉座菌目(Hypocreales)；麥角菌科(Clavicipitaceae)；擬青霉屬(Paecilomyces)。
　　 4.擬青霉屬包括的種類豐富,分布廣泛,生物學功能多樣化,目前還沒有從紅樹