湛江紅樹林中抗肺癌細胞生長和血管生成內(nèi)生真菌的篩選.pdf

1、[目的]：
　　1.湛江地區(qū)紅樹林內(nèi)生真菌的分離、純化和保存，并對分離的菌株進行分子生物學(xué)鑒定。
　　2.篩選能抑制肺癌細胞生長及肺癌體外血管生成的紅樹林內(nèi)生真菌菌株。
　　[方法]：
　　1.采集湛江地區(qū)秋茄、紅海欖、紅樹這3種紅樹林植物的根、莖、葉組織，分離、純化和保存其中的內(nèi)生真菌。
　　2.提取內(nèi)生真菌DNA，采用PCR法用通用引物對內(nèi)生真菌18S rDNA片段進行擴增，凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物后

2、進行DNA序列測定，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫中采用BLAST法對序列進行相似度比對，用Mega5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，并對DNA序列測定的菌株進行分子生物學(xué)分類。
　　3.將低溫保存的內(nèi)生真菌菌株活化、擴大培養(yǎng)及發(fā)酵，離心分離發(fā)酵培養(yǎng)所獲的各種內(nèi)生真菌，分別收集發(fā)酵上清液進行實驗。
　　4.采用MTT法分析各種內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液和菌絲體萃取物對肺癌細胞A549和NCI-H460生長增殖的影響;
　　5.建立HPV-

3、16 E7癌蛋白誘導(dǎo)的肺癌體外血管生成模型，觀察各種內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液對HPV-16 E7癌蛋白誘導(dǎo)的肺癌體外血管生成的影響。
　　[結(jié)果]：
　　1.本研究從湛江地區(qū)3種紅樹林植物的根、莖、葉等組織中分離、純化了內(nèi)生真菌共92株，其中從秋茄、紅海欖、紅樹分離和純化的內(nèi)生真菌分別為33株、32株和27株，經(jīng)DNA序列測定和BLAST序列比對成功鑒定出其中的62株菌株，主要包括新殼梭孢屬、擬莖點霉屬、擬盤多毛孢菌屬、青霉菌屬、

4、木霉菌屬、肉座菌屬等。
　　2.MTT實驗結(jié)果顯示10株菌株，包括新殼梭孢屬(Neofusicoccum sp.)4株—zj-2、zj-14、zj-17和zj-67;擬莖點霉屬(Phomopsis sp.)4株—zj-12、zj-23、zj-36和zj-70;小光殼屬(Leptosphaerulina sp.)和青霉菌(Penicillium sp.)各1株，分別為j-9和zj-25;其上清液能明顯抑制肺癌細胞A549和NCI-H

5、460細胞生長增殖，對A549細胞生長增殖抑制率分別為64.4％、59.5％、81.9％、43.9％、58.3％、56.2％、48.3％、42.4％、93.0％、49.7％，對NCI-H460細胞生長增殖的抑制率分別為41.2％、49.3％、82.7％、40.7％、53.9％、52.6％、56.8％、64.3％、91.0％、45.6％;其中以菌株j-9和zj-17抑制效果最好。
　　3.體外血管生成實驗顯示兩株新殼梭孢屬（zj-1

6、4和zj-17）和一株擬莖點霉屬(zj-36)的上清液可抑制HPV-16 E7癌蛋白誘導(dǎo)的肺癌體外血管生成，對A549細胞體外血管生成抑制率分別為58.7％、75.8％和65％，對NCI-H460細胞體外血管生成的抑制率分別為80％、69.5％和81.8％。
　　[結(jié)論]：
　　本研究從秋茄、紅海欖、紅樹3種紅樹林植物組織中分離、純化了內(nèi)生真菌共92株，成功鑒定了其中的62株菌株，篩選到了具有抗肺癌細胞生長增殖活性的菌株10