大麻素Ⅱ型受體調(diào)節(jié)阿爾茨海默病樣小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制研究.pdf

1、目的:以大麻素Ⅱ型受體（cannabinoid receptor2, CB2R）激動劑和CB2R基因敲除小鼠（CB2R knockout mice, CB2RKO）為工具，正反兩方面研究CB2R對阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）模型小鼠中β-淀粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）誘導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥和學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制，為CB2R成為AD等神經(jīng)退行性疾病抗炎治療新型藥物候選靶標(biāo)提供更多的理論依

2、據(jù)。
　　方法:
　　1.行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　分別選取6、8月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠（發(fā)病早、中期）開始接受連續(xù)8周選擇性 CB2R激動劑 JWH-015處理（腹腔注射，0.5mg/kg/天）；于8、10月齡時(shí)通過新奇物體識別實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮來評價(jià)JWH-015處理對APP/PS1小鼠非空間和空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；利用CB2RKO小鼠建立Aβ1-42雙側(cè)海馬CA1腦區(qū)注射AD模型（CB2RKO小鼠AD

3、模型）研究JWH-015調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力作用與CB2R之間的特異性關(guān)系以及CB2R缺失對AD模型小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　2.Aβ病理性沉積
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過剛果紅染色觀察JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠皮層、海馬腦區(qū)Aβ斑塊沉積數(shù)目的影響。
　　3.膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性
　　通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測JWH-015處理和CB2R缺失對AD模型小鼠皮層、海馬腦區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子

4、型鈣結(jié)合受體分子1（ionized calcium-binding receptor adapter molecular1, Iba1）和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫熒光強(qiáng)度的影響。
　　4.小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型
　　通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測JWH-015處理和CB2R缺失對AD模型小鼠前額葉皮層（prefrontal cortex, P

5、FC）和海馬腦區(qū)內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物白細(xì)胞介素6（interleukin6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS），M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物幾丁質(zhì)酶3樣蛋白（chitinase-3 like protein, Ym1/2）以及CB2R mRNA表達(dá)的影響。
　　5.神經(jīng)元樹突復(fù)

6、雜性
　　通過高爾基染色技術(shù)觀察JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠PFC和海馬齒狀回（denate gyrus, DG）腦區(qū)內(nèi)錐體神經(jīng)元樹突長度、分枝節(jié)點(diǎn)數(shù)和棘突密度的影響。
　　6.神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力
　　將5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine, BrdU）腹腔注射摻入處于增殖期的神經(jīng)干細(xì)細(xì)胞后，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測 JWH-015處理對8、10月齡APP/PS1小鼠海馬DG區(qū)

7、BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CB2R與非空間學(xué)習(xí)記憶能力
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型組小鼠新奇物體識別指數(shù)均顯著降低（P<0.001和P<0.05），提示8、10月齡APP/PS1小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損；與同齡 APP/PS1模型組相比，8、10月齡 APP/PS1+JWH-015處理組小鼠新奇物體識別指數(shù)均顯著提高（P<0.001和P<0.05），提示

8、JWH-015處理能夠顯著改善AD模型小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力。為了研究JWH-015上述促認(rèn)知能力作用與CB2R之間的特異性關(guān)系以及CB2R缺失對AD模型非空間學(xué)習(xí)能力損傷的影響，我們在CB2RKO小鼠AD模型上進(jìn)行了新奇物體識別實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，與CB2RKO小鼠空白對照組相比，CB2RKO小鼠AD模型組的新奇物體識別指數(shù)也顯著降低（P<0.05），并且JWH-015處理對其新奇物體識別指數(shù)無顯著性影響，提示JWH-015特異性作用于C

9、B2R提高AD模型小鼠PFC腦區(qū)依賴的非空間學(xué)習(xí)記憶能力。與 WT小鼠 AD模型組相比， CB2RKO小鼠 AD模型組新奇物體識別指數(shù)顯著下降（P<0.05），提示CB2R缺失加重AD模型小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。以上研究表明， CB2R在AD模型的非空間學(xué)習(xí)記憶能力方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　CB2R與空間學(xué)習(xí)記憶能力
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型組小鼠第5天上臺潛伏期均顯著延長（P<0.0

10、5和 P<0.05）、第6天穿臺次數(shù)均顯著減少（P<0.05和P<0.05），提示AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損；與同齡APP/PS1模型組相比，8月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠上臺潛伏期顯著縮短（P<0.05），而10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠上臺潛伏期和穿臺次數(shù)均未見顯著改變，提示JWH-015激動CB2R對發(fā)病早期 APP/PS1小鼠海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力作用要強(qiáng)于發(fā)病中期。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

11、表明，CB2R對AD模型小鼠的PFC腦區(qū)依賴的非空間學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)作用要強(qiáng)于海馬腦區(qū)依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力。為了研究CB2R對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力調(diào)節(jié)作用是否與腦內(nèi)Aβ相關(guān)病理改變有關(guān)，我們開展如下機(jī)制探索。
　　2.CB2R與Aβ病理性沉積
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型組小鼠皮層、海馬腦區(qū)均出現(xiàn)剛果紅染色陽性的Aβ斑塊，且數(shù)目隨月齡增加而增多；與同齡APP/PS1模型組相比，8、10月

12、齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠皮層、海馬腦區(qū)Aβ斑數(shù)目均未見顯著變化，提示JWH-015激動CB2R對AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊病理性沉積無影響。
　　3.CB2R與膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型組小鼠皮層、海馬腦區(qū)內(nèi)Iba1、GFAP免疫熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)（P<0.05）；與同齡APP/PS1模型組相比，8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠皮層腦區(qū)I

13、ba1免疫熒光強(qiáng)度顯著下降（P<0.05和 P<0.01），而海馬腦區(qū) Iba1和皮層、海馬腦區(qū)GFAP的免疫熒光強(qiáng)度均無顯著性影響，提示JWH-015處理能夠腦區(qū)特異性地降低小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。而為了研究JWH-015對小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用與CB2R之間的特異性關(guān)系并研究CB2R缺失對小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性的影響，我們在CB2RKO小鼠AD模型上檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1的免疫熒光強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，與CB2RKO空白對照組相比

14、， CB2RKO小鼠 AD模型組的 Iba1免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.05），且 JWH-015處理對其 Iba1免疫熒光強(qiáng)度無顯著性影響，提示JWH-015特異性作用于CB2R調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。同時(shí)，與WT小鼠AD模型組相比，CB2RKO小鼠AD模型組Iba1免疫熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)的趨勢，且小膠質(zhì)細(xì)胞激活形態(tài)明顯改變：胞體增大，分枝粗短而密集。此外，Aβ1-42雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射AD模型小鼠各處理組間GFAP免疫熒光強(qiáng)度未

15、見顯著差異，提示AD模型小鼠的行為學(xué)改變可能并不依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CB2R對AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性和激活形態(tài)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。為了驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞激活形態(tài)的差異是否引起功能作用的轉(zhuǎn)變，我們進(jìn)行了小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的研究。
　　4.CB2R與小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型組小鼠PFC、海馬腦區(qū)內(nèi)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IL

16、-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平不同程度地上調(diào)，提示 AD模型小鼠腦內(nèi)促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增高；與同齡APP/PS1模型組相比，8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠PFC、海馬腦區(qū)IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)不同程度地下調(diào)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ym1/2 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05），且JWH-015在PFC腦區(qū)上述作用程度較海馬腦區(qū)顯著，提示JWH-015激動CB2R能夠促進(jìn)AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內(nèi)

17、小膠質(zhì)細(xì)胞的功能表型轉(zhuǎn)化。而為了研究JWH-015調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的作用與 CB2R之間的特異性關(guān)系并研究CB2R缺失對小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的影響，我們在CB2RKO小鼠AD模型上檢測了M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，與CB2RKO小鼠空白對照組相比，CB2RKO小鼠AD模型組PFC腦區(qū)內(nèi)IL-6、TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)水平顯著增高（ P<0.001、P<0.01和P=0.0507），且Ym1/2

18、 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），同時(shí)JWH-015處理對其IL-6、TNF-α、iNOS和Ym1/2 mRNA表達(dá)水平無顯著性影響，提示JWH-015特異性作用于CB2R調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的轉(zhuǎn)化。而與WT小鼠AD模型組相比，CB2RKO小鼠AD模型組PFC腦區(qū)內(nèi)IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平均顯著增加（P<0.01和P<0.05），提示CB2R缺失顯著增強(qiáng)AD模型小鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。此外，與同齡野生型對照組相

19、比，8、10月齡APP/PS1模型小鼠PFC、海馬腦區(qū)內(nèi)CB2R mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），但JWH-015處理對CB2R mRNA表達(dá)水平無顯著影響。上述研究結(jié)果表明，CB2R在AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)性、激活形態(tài)和功能表型轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，并與其在認(rèn)知能力方面的改善作用關(guān)系密切。
　　5.CB2R與神經(jīng)元樹突復(fù)雜性
　　與同齡野生型對照組相比，8、10月齡APP/PS1模型

20、組小鼠PFC腦區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突長度、分枝節(jié)點(diǎn)數(shù)、棘突密度和DG腦區(qū)錐體神經(jīng)元棘突密度均顯著下降（P<0.001），提示AD模型小鼠不同功能腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元樹突復(fù)雜性的下降可能與其認(rèn)知能力損傷有關(guān)。與同齡 APP/PS1模型組相比，8、10月齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠PFC腦區(qū)錐體神經(jīng)元樹突長度、樹突分枝節(jié)點(diǎn)數(shù)以及棘突密度均顯著性增加（P<0.001），DG區(qū)神經(jīng)元棘突密度無顯著性影響，提示JWH-015激動CB2R能夠腦區(qū)

21、依賴性地改善AD模型小鼠神經(jīng)元樹突復(fù)雜性，這可能是與CB2R在不同功能腦區(qū)的炎性調(diào)節(jié)作用有關(guān)，但目前研究結(jié)果無法確定兩者的關(guān)系。
　　6.CB2R與神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力
　　與同齡野生型對照組相比，8月齡 APP/PS1模型組小鼠海馬 DG區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著性變化，而10月齡APP/PS1模型組小鼠則顯著減少（P<0.01），提示發(fā)病中期 AD模型小鼠出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力下降。與同齡APP/PS1模型組相比，10月

22、齡APP/PS1+JWH-015處理組小鼠海馬DG區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05），提示JWH-015激動CB2R能夠顯著增強(qiáng)APP/PS1小鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力，可能與 CB2R調(diào)節(jié)海馬腦區(qū)炎性微環(huán)境的作用有關(guān)，但缺少直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，需要進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：
　　特異性激動CB2R能夠顯著提高AD模型小鼠非空間學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與腦區(qū)特異性地調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥，改善神經(jīng)干細(xì)胞增殖