六味地黃活性部位對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習記憶能力的影響及其機制研究.pdf

1、研究目的:阿爾茨海默病(AD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失。目前臨床上并無理想的治療AD的藥物。六味地黃湯(LW)是中醫(yī)滋補腎陰的經(jīng)典代表名方，臨床和藥理學(xué)研究表明，LW具有防治AD的作用。六味地黃苷糖(LW-AFC)是來源于LW的中藥五類新藥，由LWD-b（糖苷部位）、LWB-B（多糖部位）和CA-30（寡糖部位）三個活性部位組成。本室前期研究結(jié)果表明，LW

2、-AFC能夠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)(NIM)網(wǎng)絡(luò)平衡來改善AD模型小鼠的認知功能。為進一步明確LW中發(fā)揮上述藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用原理，本研究研究了組成LW-AFC的三個活性部位及其中的部分活性成分對AD模型動物學(xué)習記憶能力的作用及可能的作用環(huán)節(jié)或機制，并與LW原方(LW)及LW活性部位復(fù)方（LW-AFC）進行了比較。
　　研究方法:選擇快速老化小鼠(SAMP8)作為散發(fā)型AD(SAD)模型小鼠，選擇PrP-hAβPPswe

3、/PS1dE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠作為家族型AD(FAD)模型小鼠，分別灌胃給予三個活性部位(LWD-b、LWB-B或CA-30)，并設(shè)置LW、LW-AFC、美金剛及多奈哌齊組作為具有不同作用機制的藥物對照組。分別灌胃給予7月齡SAMP8小鼠LW、LW-AFC、LWD-b、LWB-B或CA-30三個月，灌胃給予10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠LW、LW-AFC、CA-30(0.48、0.96、1.92g/kg)或水蘇糖(STA)

4、三個月，通過老化度評分以及筑巢實驗觀察它們對動物老化狀態(tài)的影響;通過腦體比考察對腦萎縮程度的影響;通過自主活動性、新異物體識別實驗、Morris水迷宮實驗和穿梭箱實驗，考察對學(xué)習記憶能力等行為學(xué)的影響;采用AlphaLISA技術(shù)，檢測對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬及外周血中Aβ1-42含量的影響。為探討LW活性部位及活性成分的作用環(huán)節(jié)或機制，采用放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測對模型小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和下丘腦-垂體-性腺

5、軸（HPG）中相關(guān)激素水平的影響;并采用流式細胞術(shù)檢測脾和外周血淋巴細胞亞型、采用液相蛋白芯片技術(shù)檢測血漿中細胞因子的含量。
　　研究結(jié)果:
　　第一章六昧地黃活性部位對學(xué)習記憶能力的作用研究
　　一、LW活性部位對SAMP8小鼠學(xué)習記憶能力的作用研究
　　與SAMR1比較，SAMP8小鼠老化評分略有增高、腦重/體重比值及海馬/體重比值明顯下降，自主活動能力、筑巢能力和主動回避反應(yīng)能力不同程度降低。三個活性部位中

6、，除LWD-b外，LWB-B和CA-30均對上述指標的變化具有不同程度地改善作用，其中，CA-30對SAMP8小鼠的老化度、筑巢能力、自主活動性、主動回避反應(yīng)能力和空間學(xué)習記憶能力有明顯改善作用，LWB-B對腦萎縮、自主活動性和主動回避反應(yīng)能力具有明顯改善作用。對照藥LW和LW-AFC可顯著降低SAMP8小鼠老化度、改善腦萎縮及提高筑巢能力，而美金剛和多奈哌齊除可提高SAMP8小鼠的自主活動度和主動回避反應(yīng)能力外，對其它老化相關(guān)指標及學(xué)

7、習記憶相關(guān)指標均無明顯改善作用。以上研究結(jié)果表明，CA-30部位在LW三個活性部位中對SAMP8老化及學(xué)習記憶能力的改善作用最為突出，值得進一步進行深入研究。
　　二、CA-30及其活性成分STA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習記憶能力的作用研究
　　選用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，深入研究了CA-30改善學(xué)習記憶能力的量效關(guān)系，并與組成CA-30的主要活性成分STA(0.45 g/kg)的作用進行了比較。結(jié)果表明，與野生型小鼠

8、相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠筑巢能力、短期物體記憶能力、主動回避反應(yīng)能力和空間學(xué)習記憶能力均明顯降低。三個劑量的CA-30（0.48，0.96和1.92g/kg）以及STA對上述指標的改變具有不同程度的改善作用，但未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，CA-30的主要活性成分STA在0.45 g/kg劑量時對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習記憶能力的作用強度與中劑量CA-30(0.96g/kg)相當。
　　綜合上述結(jié)果可以看出，在LW活性部位中，

9、LWB-B、CA-30及活性成分STA能不同程度地改善SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的老化狀態(tài)及學(xué)習記憶能力，但CA-30可能是LW發(fā)揮改善學(xué)習記憶能力作用的主要藥效組分，LWB-B與CA-30發(fā)揮作用的側(cè)重不同，可能起輔助作用，LW對AD模型小鼠老化程度和學(xué)習記憶能力的改善作用可能主要是CA-30和LWB-B共同作用的結(jié)果。
　　第二章六味地黃活性部位改善學(xué)習記憶能力的作用機制研究
　　一、LW活性部位對NIM網(wǎng)

10、絡(luò)的調(diào)節(jié)作用研究
　　大量研究表明，SAMP8小鼠隨增齡表現(xiàn)為加速老化和學(xué)習記憶功能障礙，同時伴隨著NIM網(wǎng)絡(luò)的功能發(fā)生紊亂。本研究顯示，與對照相比，SAMP8小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌發(fā)生異常，下丘腦中CRH和GnRH、垂體中LH和TSH水平顯著增高;外周血T細胞亞群中以CD3e+CD8a+為標記的抑制性T細胞(Ts)、CD3e+CD25+為標記的活化T細胞、CD4+CD25+為標記的調(diào)節(jié)性T細胞和以F4/80+為標記的單核/巨噬細胞、以G

11、r1+為標的中性粒細胞數(shù)量顯著增加，并且輔助性T細胞與抑制性T細胞的比值(Th/Ts=CD4+/CD8a+)降低，CD19+標記的B細胞數(shù)量顯著減少，同時，促炎細胞因子TNFβ水平顯著增高，抗炎細胞因子IL-4和IL-5水平顯著降低，提示SAMP8小鼠免疫功能低下。LWD-b、LWB-B和CA-30對上述指標的變化具有不同程度的改善作用，其中，三者對神經(jīng)內(nèi)分泌指標的恢復(fù)作用基本相同，但對免疫功能相關(guān)指標的改善存在較大差異，主要表現(xiàn)為CA

12、-30除可改善外周血中T細胞亞群比例和B細胞數(shù)量外，同時也能糾正抗炎細胞因子IL-4、IL-5水平的降低，從而改善SAMP8免疫功能底下的狀態(tài);LWD-b主要改善外周血中T細胞亞群CD3e+CD8a+、CD4+CD25+細胞數(shù)量，對抗炎細胞因子和炎性細胞因子均具有明顯改善作用;而LWB-B僅對外周血中炎性細胞因子的異常具有改善作用。
　　上述結(jié)果表明，LW活性部位LWD-b、LWB-B、CA-30對SAMP8小鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)激

13、素、免疫活性細胞及相關(guān)細胞因子的異常均具有不同程度的改善作用，但三者作用的強度或側(cè)重有所不同，其中，CA-30的作用較為廣泛，可能是發(fā)揮NIM調(diào)節(jié)作用的主要部位，LWD-b及LWB-B調(diào)節(jié)免疫功能的作用較為局限，可能起著輔助或補充作用。LW三個活性部位LWD-b、LWB-B、CA-30對NIM的共同作用可能是LW改善AD學(xué)習記憶功能障礙的重要機制之一。
　　二、CA-30及其活性成分STA對免疫功能的作用研究
　　對CA-3

14、0調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫功能的研究結(jié)果表明，與野生型小鼠比較，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫功能發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為在脾臟中以CD3e+標記的T細胞數(shù)量減少，主要為以CD3e+CD4+標記的輔助T細胞、以CD3e+CD8a+標記的抑制性T細胞、以CD4+CD25+標記的調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量顯著減少。同時，以CD19+標記的B細胞數(shù)量也顯著減少，而以F4/80+標記的單核/巨噬細胞、以Gr1+標記的中性粒細胞和CD4+/CD8a+比值均顯著

15、增加。在外周血中以CD3e+標記的總的T細胞、以CD3e+CD4+標記的輔助T細胞、以CD3e+CD25+為標記的活化T細胞和以CD4+CD25+標記的調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量減少，而以F4/80+標記的單核/巨噬細胞顯著增加。三個劑量的CA-30對上述免疫功能相關(guān)指標均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，但無明顯的量效關(guān)系，且不同劑量下的調(diào)節(jié)范圍各有側(cè)重，對于CD4+CD25+細胞數(shù)量的減少，中劑量CA-30(0.96/kg)作用顯著，對于CD4+/CD8a

16、+比值的升高，小劑量(0.48/kg)作用明顯。STA的作用與CA-30類似，提示其是CA-30中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要活性成分。與LW及LW-AFC的免疫調(diào)節(jié)作用進行比較發(fā)現(xiàn)，CA-30的作用基本與LW相似。
　　綜合以上結(jié)果可以看出，三個活性部位(LWD-b、LWB-B和CA-30)能不同程度地調(diào)節(jié)SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的NIM網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，三個活性部位對于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用類似，但對免疫系統(tǒng)的作用各

17、有側(cè)重，其中CA-30的作用較為全面，而LWD-b對炎性及抗炎細胞因子、LWB-B僅對炎性細胞因子的異常有調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果提示，三個活性部位中CA-30是發(fā)揮調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)作用的主要活性部位，LWD-b和LWB-B起輔助或補充調(diào)節(jié)作用，三者共同作用可能是LW調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)平衡，發(fā)揮改善學(xué)習記憶能力的可能機制。
　　研究結(jié)論:
　　1.LW三個活性部位中，CA-30和LWB-B能夠不同程度地改善AD模型小鼠的學(xué)習記憶能力，其

18、中，CA-30的作用廣泛，可顯著降低老化度，改善筑巢能力、主動回避反應(yīng)能力、物體識別記憶能力、空間學(xué)習記憶能力，可能是LW發(fā)揮改善學(xué)習記憶功能作用的主要藥效組分，LWB-B和LWD-b對CA-30具有輔助或補充作用，三者協(xié)作發(fā)揮改善AD模型小鼠老化程度和學(xué)習記憶功能的作用。
　　2.LW三個活性部位LWD-b、LWB-B和CA-30能夠不同程度地調(diào)節(jié)SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的NIM網(wǎng)絡(luò)失衡，CA-30可能為其