LW-AFC對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用及作用機(jī)理研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer`s disease，AD）屬神經(jīng)退行性疾病，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病。AD患者腦內(nèi)典型的病理變化主要包括腦細(xì)胞外的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）斑塊即老年斑（senile plague）、細(xì)胞內(nèi)沉積的磷酸化tau蛋白引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失。AD的臨床癥狀主要為進(jìn)行性的記憶損害以及其他認(rèn)知功能的下降，AD患者確診后的平均存活時(shí)間為9年，期間必須有專(zhuān)人進(jìn)行看護(hù)，

2、因此AD對(duì)于社會(huì)、家庭都是巨大的負(fù)擔(dān)。目前用于AD治療的藥物主要分為乙酰膽堿酯酶抑制劑和 N-甲基-D-天冬氨酸（ N-Methyl-D-Aspartate，NMDA）受體拮抗劑兩大類(lèi)，分別靶向膽堿能和谷氨酸能突觸傳遞。其中乙酰膽堿酯酶抑制劑主要針對(duì)治療輕中度AD，而NMDA受體拮抗劑主要治療中重度AD。但是臨床數(shù)據(jù)顯示，這些藥物對(duì)于AD的治療效果并不理想，僅能夠改善部分癥狀。此外，抗精神病藥、抗抑郁藥、抗驚厥藥、免疫療法、β-分泌酶/

3、γ-分泌酶抑制劑、α-分泌酶激動(dòng)劑、tau蛋白聚集/磷酸化抑制劑、金屬離子螯合劑和維生素也用于改善 AD患者的認(rèn)知功能和生活質(zhì)量，但治療效果依舊不理想。因此，目前為止，仍然沒(méi)有能夠有效預(yù)防或治療AD的方法。
　　上世紀(jì)90年代，我室與天然藥物化學(xué)研究室及沈陽(yáng)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室密切合作，對(duì)中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典代表名方六味地黃湯的藥理作用、作用機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。研究表明，六味地黃湯對(duì)快速老化模型小鼠SAMP8等多

4、種模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力低下具有明顯改善作用。LW-AFC是從六味地黃湯中分離獲得的由活性成分群構(gòu)成的中藥新藥，主要含苷類(lèi)（LWD-b）、多糖（LWB-B）和寡糖（CA-30）三個(gè)主要藥效組分，具有藥效穩(wěn)定、質(zhì)量可控、制劑先進(jìn)、服用方便等優(yōu)點(diǎn)。該藥已獲臨床批件，申報(bào)的第一個(gè)適應(yīng)癥為更年期綜合征，目前正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。
　　本研究以快速老化小鼠 SAMP8和家族型 AD（familial Alzheimer`s disease

5、， FAD）模型小鼠 PrP-hAβPPswe/PS1ΔE9（APP/PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型，研究了LW-AFC對(duì)中樞學(xué)習(xí)記憶能力、病理改變以及生物標(biāo)志物的作用。以高月齡自然衰老小鼠 SAMR1為衰老模型，觀察 LW-AFC的抗衰老作用。通過(guò)檢測(cè) HPA軸和HPG軸中的激素水平、脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、脾淋巴細(xì)胞的亞群分型以及血漿中細(xì)胞因子的水平，揭示LW-AFC防治AD的作用機(jī)制及靶點(diǎn)。
　　第一部分 LW-AFC改善中樞學(xué)習(xí)

6、記憶功能的作用研究
　　1. LW-AFC對(duì)SAMP8小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用研究
　　選取6月齡雄性SAMP8小鼠，分別灌胃給予多奈哌齊（donepezil）（1mg/kg）、美金剛（memantine）（10mg/kg）、LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg），以SAMR1小鼠作為對(duì)照。3個(gè)月后進(jìn)行老化程度評(píng)分和自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，觀察 LW-AFC對(duì)SAMP8小鼠衰老程度的影響；運(yùn)用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭箱

7、實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以及新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，觀察LW-AFC對(duì)SAMP8小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用。結(jié)果顯示，給予1.6g/kg的LW-AFC能夠明顯降低SAMP8小鼠的老化評(píng)分；美金剛和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg）能夠顯著提高SAMP8小鼠的自主活動(dòng)度；1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高 SAMP8小鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)能力；美金剛、0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SA

8、MP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和主動(dòng)回避反應(yīng)能力；1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SAMP8小鼠的短、長(zhǎng)期物體識(shí)別記憶能力。該結(jié)果表明，LW-AFC能夠有效降低SAMP8小鼠的衰老程度，改善其學(xué)習(xí)記憶能力，且效果要優(yōu)于陽(yáng)性藥多奈哌齊和美金剛。
　　2. LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用研究
　　選取 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為 FAD的模型小鼠，分別灌胃給予多奈哌齊（1mg/kg）、美金剛（

9、10mg/kg）、LW-AFC（1.6g/kg），C57小鼠作為對(duì)照。3個(gè)月后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以及新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，觀察LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用；采用免疫熒光染色和尼氏染色，觀察LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ的沉積與神經(jīng)元丟失的作用；采用 AlphaELSA技術(shù)檢測(cè)血液和腦組織中的可溶性 Aβ含量，觀察 LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ水平的影響

10、。結(jié)果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于野生型小鼠，給予 LW-AFC、美金剛和多奈哌齊能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)能力；LW-AFC和美金剛能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶能力；LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的短期物體識(shí)別記憶能力和被動(dòng)回避反應(yīng)能力；與野生型小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ斑塊、海馬和血漿中Αβ1-40和Αβ1-42的水平明顯升高，海馬、

11、CA1區(qū)和CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量明顯降低，給予LW-AFC、美金剛均能夠顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的Aβ沉積，降低海馬中的Αβ1-42水平，同時(shí)LW-AFC還能降低外周血中的Αβ1-42含量。LW-AFC能夠明顯增加海馬中，特別是CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量。該結(jié)果表明，LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并明顯減少腦中Aβ斑塊和神經(jīng)元丟失，同時(shí)降低腦和血液中的可溶性Aβ水平。
　　3. LW-

12、AFC對(duì)自然衰老SAMR1小鼠延緩衰老的作用研究
　　使用12月齡和24月齡的SAMR1小鼠作為衰老小鼠模型，分別灌胃給予褪黑素（melatonin）（1mg/kg）和LW-AFC（1.6g/kg），7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠作為對(duì)照。3個(gè)月后進(jìn)行老化評(píng)分、生存期、體重變化、自主活動(dòng)、空間學(xué)習(xí)記憶等指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示，12和24月齡SAMR1小鼠的老化評(píng)分要明顯高于對(duì)照組7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠，給予LW-AFC

13、能夠分別在給藥30天和45天后，顯著降低12和24月齡SAMR1小鼠的老化評(píng)分；LW-AFC能夠明顯提高12月齡SAMR1小鼠的生存率和平均生存天數(shù)，以及12和24月齡SAMR1小鼠的平均體重；LW-AFC能夠顯著改善12和24月齡的SAMR1小鼠的空間記憶能力。表明LW-AFC能夠延緩自然衰老SAMR1小鼠的衰老進(jìn)程。
　　第二部分 LW-AFC改善中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)理研究
　　1. LW-AFC對(duì)SAMP8小鼠NI

14、M網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對(duì)SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，采用3H-TdR摻入法檢測(cè)SAMP8小鼠脾細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞型，液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的含量，放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HPA軸和HPG軸中激素水平的變化。結(jié)果表明，SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的功能明顯紊亂，給予1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中CRH水平；0.

15、8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中GnRH水平、垂體中ACTH、LH和FSH水平；0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高血漿中T水平，而美金剛僅能降低LH的水平。
　　對(duì)于SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，美金剛和多奈哌齊能夠明顯提高Con A和 LPS刺激的SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，此外多奈哌齊還能顯著提高其脾淋巴細(xì)胞的自發(fā)增殖能力，而0.8g/k

16、g、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠明顯提高自發(fā)和Con A刺激的增殖能力，0.8g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高LPS刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　對(duì)于 SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞亞型，給予美金剛和 LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能夠顯著提高CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)量，多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg）能夠顯著提高CD8+CD28+T細(xì)

17、胞的表達(dá)量，美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg）能夠顯著提高CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量；美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能夠顯著提高CD19+CD80+B細(xì)胞的表達(dá)量，美金剛和多奈哌齊明顯降低了CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量。多奈哌齊顯著提高了 SAMP8小鼠血液中 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量，而 LW-AFC（1.6g/kg）則能夠明顯降低其表

18、達(dá)量。此外，美金剛、多奈哌齊和LW-AFC（0.8g/kg和1.6g/kg）能恢復(fù)CD4+/CD8+的平衡。
　　對(duì)于SAMP8小鼠血液中的細(xì)胞因子水平，給予SAMP8小鼠美金剛，能夠顯著降低其血液中IL-23、TNF-β和eotaxin的水平，多奈哌齊僅能夠降低IL-23的水平，LW-AFC（0.8、1.6和3.2 g/kg）則能夠明顯降低IL-1β、IL-23、GM-CSF、IFN-γ、eotaxin、TNF-α、TNF-β的

19、水平，升高M(jìn)CP-1的分泌水平，而0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低IL-2、IL-6和RANTES的水平，1.6g/kg的LW-AFC還能夠明顯提高IL-5的水平。
　　這些結(jié)果提示，LW-AFC能夠有效恢復(fù)或改善SAMP8小鼠HPA軸和HPG軸平衡，并通過(guò)增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力、恢復(fù)失衡的淋巴細(xì)胞亞型、調(diào)控異常分泌的細(xì)胞因子等途徑，調(diào)節(jié)或改善免疫功能，進(jìn)而對(duì)SAMP8小鼠處于平衡失調(diào)、功能紊亂狀態(tài)的NIM網(wǎng)

20、絡(luò)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，改善或恢復(fù)其平衡狀態(tài)。
　　2. LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，采用放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠HPA軸和HPG軸的變化；液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的含量。結(jié)果表明，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的NIM網(wǎng)絡(luò)平衡紊亂，給予美金剛和LW-AFC能夠顯著降低APP/PS1轉(zhuǎn)基

21、因小鼠的垂體中的ACTH水平；LW-AFC能夠明顯降低下丘腦中的GnRH、垂體中的FSH和LH的水平，美金剛則能夠顯著降低FSH和LH的水平。美金剛、多奈哌齊和 LW-AFC都能夠顯著提高 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞上清液中CD8+CD28+T細(xì)胞的表達(dá)量，美金剛和 LW-AFC則能夠明顯降低CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量。美金剛能夠顯著降低 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血液中IL-1β、IL-6、IL-23、GM-CSF

22、和TNF-β的水平，多奈哌齊僅能降低IL-1β的水平，LW-AFC則能夠顯著降低IL-1β、IL-2、IL-6、IL-23、GM-CSF、TNF-α、TNF-β和eotaxin的分泌水平，同時(shí)還能夠明顯提高IL-4和G-CSF的水平。該結(jié)果表明，LW-AFC能夠調(diào)節(jié)或改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的功能紊亂。
　　3. LW-AFC對(duì)自然衰老SAMR1小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用
　　為觀察LW-AFC對(duì)衰老動(dòng)物模型NI

23、M網(wǎng)絡(luò)中“免疫衰老”的作用，采用3H-TdR摻入法檢測(cè)高月齡SAMR1小鼠脾細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞型；液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的含量。結(jié)果表明，12和24月齡的SAMR1小鼠都具有一定程度的免疫功能低下和慢性炎癥。給予褪黑素和LW-AFC能夠顯著提高12月齡 SAMR1小鼠脾細(xì)胞的自發(fā)增殖能力，同時(shí)褪黑素和 LW-AFC還能夠提高12和24月齡SAMR1小鼠Con A和LPS刺激的脾細(xì)胞增殖能力。對(duì)于脾淋巴

24、細(xì)胞亞型，褪黑素能夠明顯恢復(fù)12和24月齡的SAMR1小鼠CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量以及12月齡SAMR1小鼠的CD4+/CD8+的比值和24月齡SAMR1小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量；LW-AFC能顯著恢復(fù)12和24月齡的SAMR1小鼠 CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量，同時(shí)還能改善24月齡的SAMR1小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+

25、/CD8+和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)紊亂。褪黑素能夠明顯改善12月齡SAMR1小鼠外周血中9個(gè)促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α）以及全部抗炎因子（G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10）的水平異常，也能改善24月齡SAMR1小鼠外周血中8個(gè)促炎因子（GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-

26、α、TNF-β）和1個(gè)抗炎因子（IL-4）的水平異常；給予LW-AFC能夠顯著改善12月齡SAMR1小鼠外周血中11個(gè)促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β）以及全部抗炎因子（G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10）的水平異常，也能夠改善24月齡SAMR1小鼠外周血中12個(gè)促炎因子（eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL

27、-1β、IL-2、IL-6、IL-17、MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β）的水平異常，但對(duì)抗炎因子無(wú)效。該結(jié)果提示，LW-AFC能夠通過(guò)調(diào)節(jié)高月齡SAMR1小鼠的免疫功能低下，降低慢性炎癥，延緩SAMR1小鼠的免疫衰老。
　　4. LW-AFC對(duì)NIM網(wǎng)絡(luò)的作用靶點(diǎn)分析
　　為深入研究LW-AFC改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的作用靶點(diǎn)。采用Pearson相關(guān)性分析的方法，對(duì)

28、SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)中激素、細(xì)胞因子與其認(rèn)知功能相關(guān)性進(jìn)行了研究與分析，發(fā)現(xiàn)NIM網(wǎng)絡(luò)與認(rèn)知功能具有相關(guān)性；采用多重線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)內(nèi)分泌方面，HPG軸中的LH、T和GnRH與SAMP8小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)；HPG軸的T和LH，HPA軸中的ACTH與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)。在細(xì)胞因子方面，Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α），IL-23，趨化因子（

29、eotaxin、RANTES）與 SAMP8小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)；Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-6)，趨化因子（eotaxin）與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)。對(duì)于SAMP8小鼠，LW-AFC可調(diào)節(jié)與認(rèn)知功能緊密相關(guān)的分子為：GnRH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin、RANTES。對(duì)于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，LW-AFC可調(diào)節(jié)與認(rèn)知功能緊密相關(guān)的分子為：AC

30、TH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示這些分子有可能是LW-AFC防治AD的潛在作用靶標(biāo)，對(duì)不同的AD動(dòng)物模型，LW-AFC能夠通過(guò)作用于不同的靶點(diǎn)，改善不同原因所導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷。
　　通過(guò)以上研究，本研究主要得出以下結(jié)論：
　　1. LW-AFC能夠改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動(dòng)、被動(dòng)回避反應(yīng)能力、空間學(xué)習(xí)記憶能力和物體識(shí)別記憶能力；此外，能降低自然衰老SAMR1小鼠的老化度評(píng)分、

31、延長(zhǎng)生存期，表明長(zhǎng)期口服給予LW-AFC對(duì)AD模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能具有明顯改善作用，并具有明顯抗衰老作用。
　　2. LW-AFC能夠明顯改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的HPA軸和 HPG軸平衡失調(diào)，糾正或改善淋巴細(xì)胞亞型分布及細(xì)胞因子分泌異常；此外，改善和調(diào)節(jié)自然衰老SAMR1小鼠免疫功能，表明長(zhǎng)期口服給予LW-AFC對(duì)AD模型動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能紊亂均具有明顯調(diào)節(jié)作用。
　　3. LW-AFC能夠

32、改善多種模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能、改善神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫功能。對(duì)于 SAMP8小鼠，LW-AFC主要通過(guò)作用于 GnRH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin和 RANTES改善認(rèn)知；對(duì)于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，LW-AFC則主要作用于ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示LW-AFC對(duì)改善AD模型小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用是通過(guò)調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)平衡而發(fā)揮的。
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