荔枝核乙酸乙酯相抑制HepG2細胞增殖及其抗肝癌免疫調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、1.研究目的與意義
　　本研究的目的是對荔枝核乙酸乙酯相(Litch seeds ethyl aetate,LEA)進行成分提取與分離，在前期研究基礎上通過體外實驗對比HepG2和MCF-7的抑瘤作用，篩選出對LEA敏感的細胞株HepG2細胞，并進一步探討LEA對HepG2細胞的增殖影響及其誘導凋亡機制；其次是闡明LEA在體內(nèi)抑制H22實體瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)機制，該成果將為荔枝核有效成分的藥理藥效深入研究提供基礎。
　　本研究

2、的意義在于初步篩選出的LEA具有抑制肝癌細胞增殖的作用，在確定可抑制腫瘤細胞增殖的基礎上，分析其可能的藥效成分為總黃酮類化合物，這將為荔枝核抗腫瘤藥理作用的深入研究及新藥研發(fā)提供有應用價值的基礎數(shù)據(jù)。
　　2.研究方法
　　2.1.LEA的提取、分離及有效成分鑒別
　　本實驗采用70％乙醇浸提，并結(jié)合超聲助提的方法獲取荔枝核總化合物成分，再通過萃取分離、干燥獲得 LEA，作為抗腫瘤實驗的藥物成分；再采用鹽酸-鎂粉反應方

3、法鑒別LEA中的總黃酮成分，同時采用紫外分光光度法測定總黃酮的含量。
　　2.2.LEA對HepG2、MCF-7細胞增殖抑制作用
　　本研究通過對比肝癌HepG2細胞、乳腺癌MCF-7細胞的抑瘤效果，利用不同濃度的LEA分別作用于腫瘤細胞24h和48h后，采用MTT法檢測LEA對腫瘤細胞的增殖抑制率并繪制抑制曲線；結(jié)晶紫染色法對 LEA作用腫瘤細胞之后細胞形態(tài)學變化觀察，從中選取 LEA作用效果最佳的腫瘤細胞系，然后進行體內(nèi)

4、的抗腫瘤相關機制研究。
　　2.3.LEA對小鼠淋巴細胞的增殖影響
　　為了探討 LEA對正常淋巴細胞的影響，采用小鼠原代脾臟淋巴細胞、胸腺淋巴細胞、腹腔巨噬細胞作為實驗對象，利用不同濃度的LEA分別作用于淋巴細胞24h和48h后，采用MTT法檢測LEA對淋巴細胞的增殖的影響并繪制曲線圖；分析確定LEA對正常淋巴細胞無毒性作用的藥效濃度以及可以增強淋巴細胞活性的淋巴細胞。
　　2.4.LEA對共培養(yǎng)體系的影響研究

5、>　　通過LEA對小鼠淋巴細胞的增殖篩選，選擇脾臟淋巴細胞與HepG2細胞（3:1）的比例進行共培養(yǎng)，LEA作用24h后，吸出懸浮的淋巴細胞和含藥物的培養(yǎng)液，MTT法檢測腫瘤細胞的增殖抑制率并繪制抑制曲線。研究 LEA對共培養(yǎng)體系的影響，是為探討藥物對瘤細胞及淋巴細胞共存時的藥效變化，為體內(nèi)實驗提供基礎。
　　2.5.LEA誘導肝癌HepG2細胞凋亡的分子機制
　　采用流式細胞術、DNA Ladder研究LEA對HepG2細

6、胞的凋亡機制，在不同濃度LEA作用24h后，采用Annexin-V/PI雙染凋亡檢測HepG2細胞的總凋亡率，再通過DNA Ladder實驗是否形成明顯的梯狀條帶，以此判斷LEA是否誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，以及采用羅丹明123檢測LEA誘導HepG2細胞凋亡過程中線粒體?Ψm的前后變化。
　　2.6 LEA對荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響
　　使用BALB/c小鼠腋下接種H22細胞以構(gòu)建肝癌實體瘤造模。分別采用不同濃度LEA和5

7、-Fu對肝癌小鼠進行治療，分為模型組、陽性對照組、藥物（高、中、低）劑量組，灌胃給藥1次/d,連續(xù)10天。每天觀察小鼠生活狀態(tài)，實驗結(jié)束后將各組小鼠眼球取血備用，完整剝離瘤塊、胸腺和脾臟并稱重,計算抑瘤率和器官指數(shù)，同時使用MTT法測定腫瘤小鼠脾臟淋巴、胸腺淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的增殖指數(shù)；ELISA法檢測血清中IL-1β、TNF-α、INF-γ的分泌情況。
　　3.研究結(jié)果
　　3.1.LEA提取與鑒定
　　經(jīng)過荔枝

8、核干燥醇提萃取獲得 LEA，經(jīng)紫外分光光度法鑒定，LEA總黃酮含量（以蘆丁計）為0.91mg/ml，荔枝核粗提取物總黃酮含量（以蘆丁計）為0.21mg/ml。由此可見LEA的總黃酮含量明顯高于荔枝核粗提取含量。
　　3.2.LEA對HepG2、MCF-7細胞的作用
　　LEA作用HepG2、MCF-7細胞，24h較48h明顯，IC50分別為為59.52μg/ml、301.7μg/ml；在經(jīng)過結(jié)晶紫染色法鑒定，藥物濃度在30μ

9、g/ml-240μg/ml范圍內(nèi)，藥物濃度越高，貼壁細胞越少，結(jié)晶紫染色就越淺。通過以上結(jié)果比較，LEA對 HepG2細胞的抑制效果比MCF-7明顯，下一步的實驗將確定HepG2細胞為藥物作用細胞系。
　　3.3.LEA對小鼠脾臟淋巴細胞的影響
　　LEA在60μg/ml時對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖率達到了321.33%，與對照組相比有顯著性(P<0.01)，說明LEA在30μg/ml-240μg/ml濃度區(qū)間，對正常淋巴細胞

10、無毒性，超過240μg/ml，細胞狀態(tài)改變，異常堆積，無法清晰看出細胞橢圓形態(tài)，說明高濃度可能有毒性，因此，LEA的濃度選擇在30μg/ml-240μg/ml范圍內(nèi)進行下一步實驗。
　　3.4.LEA作用共培養(yǎng)體系的影響研究
　　在共培養(yǎng)體系中，選擇小鼠脾淋巴細胞與HepG2細胞共培養(yǎng)，單獨選用LEA為60μg/ml時對HepG2細胞的抑制率為35.28%，當LEA加入共培養(yǎng)系時抑制率達可到72.34%，抑制效果明顯增強。說

11、明 LEA可能通過促進淋巴細胞活化而更好的抑制腫瘤生長。
　　3.5.流式細胞術檢測LEA誘導肝癌HepG2細胞凋亡
　　Annexin-V/PI雙染凋亡檢測結(jié)果顯示，當LEA為60μg/ml時作用脾細胞與肝癌HepG2細胞共培養(yǎng)體系24h，總凋亡率達可達到57.78%。
　　3.6.LEA對荷瘤小鼠免疫功能的影響
　　采用Mouse IL-1β ELISA試劑盒測定，得荷瘤小鼠中劑量組(30g/kg)的血清IL

12、-1β的含量為49.79 pg/ml；中劑量組的荷瘤小鼠脾臟上清液IL-1β的分泌含量為46.32 pg/ml，表明LEA在抑制腫瘤增長的同時并對IL-1β具有促進分泌作用，提示LEA可能通過上調(diào)IL-1β分泌水平防止淋巴細胞抗腫瘤反應被抑制，增強機體免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡。
　　4.結(jié)論
　　4.1.本課題通過醇提萃取方法對LEA進行提取、分離，經(jīng)紫外分光光度法鑒定總黃酮含量為0.91mg/ml。
　　4.2.確

13、定LEA作用瘤細胞HepG2的IC50為59.52μg/ml，抑制HepG2細胞的有效濃度在30-120μg/ml之間，最大抑制率可達57.26%，并對正常淋巴細胞無毒性作用，可一定程度上起到活化免疫細胞的效應。
　　4.3.LEA作用小鼠脾淋巴細胞和肝癌HepG2細胞共培養(yǎng)體系，LEA為60μg/ml的抑制率達到72.34%，說明了共培養(yǎng)體系聯(lián)合LEA能更好的發(fā)揮抑制HepG2細胞作用。
　　4.4.通過Annexin-V

14、/PI雙染對HepG2細胞凋亡進行檢測，結(jié)果顯示LEA為60μg/ml時作用脾細胞和肝癌HepG2細胞共培養(yǎng)體系24h時，總凋亡率可達到57.78%。進一步說明LEA不但可以單獨抑制HepG2細胞的生長，同時還可以通過活化脾淋巴細胞，通過誘導瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤生長的效應。
　　4.5.進一步體內(nèi)LEA抑制H22實體瘤實驗結(jié)果表明，中劑量組的抑瘤率可達到50.15%，測定免疫細胞分泌細胞因子情況，IL-1β表達明顯增高，提示L