誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)解蛋白的信號(hào)機(jī)制及MSCs治療性應(yīng)用的初步研究.pdf

1、本研究共為五個(gè)部分,前三部分以目前實(shí)驗(yàn)室已建立的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)表皮細(xì)胞角蛋白實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),探討骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下向皮膚表皮分化中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),探討分化轉(zhuǎn)換機(jī)制。第四部分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀(guān)察HA1077促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的作用。第五部分為臨床病例觀(guān)察,在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,在臨床上選擇老年性慢性褥瘡,觀(guān)察異體MSCs創(chuàng)面移植對(duì)創(chuàng)面愈合的作用,為進(jìn)一步治療提供依據(jù)。
　　 第一部分:p38、ERK信號(hào)阻斷對(duì)大鼠

2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)表皮細(xì)胞角蛋白的影響
　　 目的：探討ERK、p38兩條信號(hào)通路對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)表皮細(xì)胞角蛋白的影響。
　　 方法：采用Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液分離擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)志的檢測(cè)。對(duì)照組采用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,誘導(dǎo)組采用條件培養(yǎng)基等定向誘導(dǎo)MSCs分化表達(dá)角蛋白；p38阻斷組在誘導(dǎo)條件下加入p38抑制劑SB203580,ERK阻

3、斷組在誘導(dǎo)條件下加入ERK抑制劑PD98059,培養(yǎng)7天后免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞角蛋白CK5/8、CK19進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：大鼠骨髓MSC可在體外擴(kuò)增15代,免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)試結(jié)果顯示CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性,CD34、CD45表達(dá)陰性。7天后流式細(xì)胞儀顯示誘導(dǎo)組CK5/8、CK19陽(yáng)性率分別為3.01％、6.47％；p38阻斷組CK5/8、CK19陽(yáng)性表達(dá)率分別為1.43％、5.41％,低于誘導(dǎo)組(

4、P<0.01)；ERK阻斷組CK5/8、CK19陽(yáng)性表達(dá)率分別為5.54％、7.56％,高于誘導(dǎo)組(P<0.01)。油紅0脂肪染色發(fā)現(xiàn)p38阻斷組有少量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,其它組均為陰性。
　　 結(jié)論：抑制p38途徑的激活,在一定程度上抑制MSC分化表達(dá)表皮細(xì)胞角蛋白,且促使少量MSC分化為脂肪細(xì)胞。表明p38途徑在促進(jìn)MSC分化為表皮細(xì)胞過(guò)程中起積極作用。
　　 第二部分 Rho信號(hào)阻斷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)角蛋白的影響

5、r>　　 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分化表達(dá)表皮細(xì)胞角蛋白過(guò)程中,Rho信號(hào)阻斷對(duì)其影響。
　　 方法：(1)采用Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液分離擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)志的檢測(cè)。(2)定向誘導(dǎo)中磷酸化P38和ERK表達(dá):分為正常對(duì)照組、單純誘導(dǎo)組、Rho阻斷組；培養(yǎng)1、3、5、7d后,流式細(xì)胞檢測(cè)磷酸化P38和ERK。(3

6、)HA1077對(duì)CK5/8、CK19的影響:第3代的大鼠MSCs接種培養(yǎng)瓶。對(duì)照組加入D MEM完全培養(yǎng)液；誘導(dǎo)組:70％完全培養(yǎng)液+30％大鼠成纖維細(xì)胞上清液+8ngEGF的培養(yǎng)液；Rho阻斷1組:在誘導(dǎo)液基礎(chǔ)上,同時(shí)加入終濃度為10umol/L的HA1077；Rho阻斷2組:在誘導(dǎo)液基礎(chǔ)上,同時(shí)加入終濃度為30umol/L的HA1077。取培養(yǎng)7天的細(xì)胞,流式細(xì)胞檢測(cè)CK5/8、CK19表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)大鼠骨髓MS

7、Cs在體外擴(kuò)增后,免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD44表達(dá)陽(yáng)性,CD34、CD45表達(dá)陰性。(2)磷酸化P38正常對(duì)照水平為0.02％。在誘導(dǎo)組1d(0.01％)、3d(0.01％)變化不大,誘導(dǎo)5d為0.04％,明顯升高,7d時(shí)(0.01％)復(fù)接近誘導(dǎo)前水平；磷酸化ERK對(duì)照水平為4.23％,誘導(dǎo)后3d(0.39％)、5d(0.40％)均呈下降趨勢(shì),7天時(shí)(5.10％)恢復(fù)至誘導(dǎo)前水平。Rho阻斷組:磷酸化P38水平

8、在1d、3d、5d和7d,分別為1.11％、71.19％、0.25％、6.86％,均升高:ERK磷酸化在1d、3d、5d和7d,分別為6.17％、4.13％、3.97％和0.41％,其中7d低于對(duì)照水平。(3)HA1077對(duì)CK5/8、CK19的影響:經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè),對(duì)照組,CK5/8為0.58％,CK19為2.04％。單純誘導(dǎo)組CK5/8為1.81％,CK19為10.19％。加入HA1077后,Rho阻斷1組:在誘導(dǎo)液基礎(chǔ)上,CK5/

9、8為21.65％,CK19為39.41％,與單純誘導(dǎo)組相比,升高顯著,P<0.01。Rho阻斷2組:CK5/8為21.07％,CK19為45.60％,與單純誘導(dǎo)組相比,升高顯著,P<0.01。
　　 結(jié)論：上游信號(hào)Rho阻斷后增加p38途徑途徑激活,一定程度上促進(jìn)MSC分化表達(dá)角蛋白。
　　 第三部分 HA-1077對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型誘導(dǎo)中細(xì)胞周期影響
　　 目的：觀(guān)察HA-1077對(duì)人骨髓間充質(zhì)

10、干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型誘導(dǎo)中細(xì)胞周期影響。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),分為分為3組:①對(duì)照組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM)；②誘導(dǎo)組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細(xì)胞上清液+8ng/mlEGF)；③HA-1077阻斷組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細(xì)胞上清液+8ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)。流式細(xì)胞檢測(cè)各組誘導(dǎo)7天后PCNA和細(xì)胞周

11、期。
　　 結(jié)果：誘導(dǎo)7天后對(duì)照組、誘導(dǎo)組、HA1077阻斷組PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為:(3.31±0.76)％、(9.78±3.33)％、(10.72±1.05)％,HA1077阻斷組最高。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn):對(duì)照組、誘導(dǎo)組、HA1077阻斷組處于G0/G1期的細(xì)胞逐漸減少,分別為(91.64±0.33)％、(87.83±0.47)％、(76.80±2.97)％；處于S期的比例分別為:(7.99±0.47)％、(11.74±0

12、.63)％、(20.21±1.01)％。HA1077阻斷組最高。
　　 結(jié)論： HA1077促進(jìn)MSCs進(jìn)入S期,并且表達(dá)PCNA增加。
　　 第四部分 HA1077促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的在體實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：觀(guān)察鹽酸法舒地爾促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)全層皮膚缺損的作用。
　　 方法：1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng):按前述方法取MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn),而誘導(dǎo)細(xì)胞則采用經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液(70％完全培養(yǎng)

13、液+30％成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基上清液+8 ng/EGF)誘導(dǎo)后7d的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.取新西蘭大耳白兔12只,按無(wú)菌手術(shù)要求在背部脊柱兩側(cè)1cm處由前至后制備6個(gè)直徑為3cm的圓形皮膚缺損(每側(cè)各3個(gè))。創(chuàng)面隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、EGF對(duì)照組(B組)、MSCs治療組(C組)、誘導(dǎo)細(xì)胞治療組(D組)、MSCs+HA1077治療組(E組)和誘導(dǎo)細(xì)胞+HA1077治療組(F組),每組各12個(gè)創(chuàng)面。創(chuàng)面按分組要求注射藥品,MSCs及誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)

14、胞濃度均為2×106/ml,每個(gè)創(chuàng)面注射細(xì)胞懸液1ml,HA1077則按濃度20μmol/L注射每一創(chuàng)面注射0.5ml,(除空白對(duì)照組外)各組創(chuàng)面均注射濃度為50U/cm2創(chuàng)面的EGF。腹腔注射抗生素鹽水10ml。隔日按各組要求注射藥品和細(xì)胞。傷后3、7、14d用透明膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣描膜,計(jì)算愈合指數(shù)(WCI),WCI=(1-處理后創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×10Q％。并記錄各創(chuàng)面愈合時(shí)間,比較各組間差異。
　　 結(jié)果： C、D

15、、E、F四組在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)愈合指數(shù)均明顯大于A(yíng)、B兩組(P<0.05),其中E組、F組愈合指數(shù)又明顯大于其它兩治療組(P<0.05)。E組和F組的平均愈合時(shí)間分別為17.25±1.29天和17.67±1.25天,也明顯快于其他組別(P<0.05)。但C組與D組之間、E組與F組之間無(wú)論愈合指數(shù)還是平均愈合時(shí)間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論： HA1077對(duì)MSCs修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面具有促進(jìn)作用。
　　 第五

16、部分 MSCs治療性應(yīng)用的初步研究
　　 目的：在皮膚微環(huán)境下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為表皮細(xì)胞的潛能。本部分研究將異體MSCs植入慢性皮膚潰瘍病人創(chuàng)面后,觀(guān)察能否促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
　　 方法：體外分離人MSCs。慢性皮膚創(chuàng)面病人2例,四個(gè)創(chuàng)面,采用同體對(duì)照,治療側(cè)創(chuàng)面植入所分離MSCs結(jié)合常規(guī)換藥治療,對(duì)照側(cè)單純常規(guī)換藥,觀(guān)察14天。計(jì)算創(chuàng)面愈合指數(shù)。
　　 結(jié)果：病例1,治療側(cè)創(chuàng)面14天時(shí)愈合指數(shù)為45％,對(duì)