人sCR1-SCR15-18片段表達(dá)產(chǎn)物的純化及其對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion，MI/R)損傷是心血管疾病治療中常見的病理生理過程，一直被認(rèn)為是影響心肌缺血性疾病治療結(jié)果的關(guān)鍵問題。MI/R損傷的病理機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要參與因素有補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞和氧自由基。許多研究均表明補(bǔ)體系統(tǒng)的激活是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集、活化和內(nèi)皮細(xì)胞損傷等一系列反應(yīng)的關(guān)鍵因素。因此抑制補(bǔ)體過度活化能在始動部位防止炎癥損傷的發(fā)生。在經(jīng)典、旁路和MBL

2、三個補(bǔ)體激活途徑中，都以C3活化為中心，sCR1的短同源重復(fù)序列(short consensus repeats，SCR)15-18段既可結(jié)合C3b，滅活C3/C5轉(zhuǎn)化酶，又能輔助Ⅰ因子裂解C3b，阻斷C5a、C5b-9等片段的生成。本文在構(gòu)建了重組工程菌pET32-sCR1-SCR15-18/BL21的基礎(chǔ)上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)sCR1-SCR15-18蛋白表達(dá)，優(yōu)化了其表達(dá)、純化及復(fù)性的條件；觀察sCR1-SCR15-18蛋白體外抑制補(bǔ)

3、體溶血反應(yīng)活性功能，體內(nèi)對急性MI/R損傷動物模型的保護(hù)作用。研究的主要內(nèi)容和取得的主要結(jié)果如下： 1．將重組工程菌pET32-sCR1-SCR15-18/BL21復(fù)蘇，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L；最佳誘導(dǎo)溫度為37℃；最佳誘導(dǎo)時間為4小時。經(jīng)SDS-PAGE分析，可見表達(dá)蛋白的大小約為46 kD，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) Western blot分析鑒定，在分子量約46 kD處出現(xiàn)

4、單一條帶，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。 2．工程菌pET32-sCR1-SCR15-18/BL21 誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)超聲裂菌，SDS-PAGE 分析，表明目的蛋白主要是以包涵體的形式存在。sCR1-SCR15-18蛋白經(jīng)Ni-NTA 柱純化后，基本無雜蛋白存在，表明采用親和層析可實(shí)現(xiàn)sCR1-SCR-15-18蛋白的一步純化。用不同透析復(fù)性條件復(fù)性目的蛋白，篩選出最佳復(fù)性條件：透析液中谷胱甘肽氧化型為0.3 mmol/L還原型為0.7 mmol

5、/L時透析復(fù)性效果較好；透析液中尿素濃度梯度逐步遞減復(fù)性效果較好。 3．體外生物學(xué)活性分析顯示，目的蛋白能抑制補(bǔ)體的溶血反應(yīng)，表明我們制備的重組蛋白在體外有抑制補(bǔ)體活性的功能。 4．36只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組和sCR1-SCR15-18保護(hù)組。建立大鼠急性MI/R損傷動物模型，結(jié)扎冠狀動脈前立即注射磷酸鹽緩沖液或sCR1-SCR15-18蛋白。測定心肌梗塞面積，血清中LDH和CK，心肌組織髓過氧化物酶(

6、MPO)活性，HE染色觀察心肌病理改變和免疫組織化學(xué)法檢測C3c。結(jié)果顯示sCR1-SCR15-18蛋白能明顯縮小心肌梗塞范圍(P<0.05)；明顯降低血清心肌酶CK，LDH含量(P<0.05)；使心肌組織MPO活性明顯下降(P<0.05)；減輕心肌病理改變及減少壞死區(qū)心肌組織中C3c的沉積，表明sCR1-SCR15-18蛋白對大鼠急性MI/R 損傷具有保護(hù)作用，這種作用是通過抑制補(bǔ)體活化發(fā)揮的。 綜上所述：本實(shí)驗(yàn)在已經(jīng)成功構(gòu)建