AFF1在P-TEFb網絡中的功能研究.pdf

1、在真核細胞中，編碼蛋白的基因轉錄是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)通過一系列復雜有序的調控機制完成的。不斷深入的研究表明過去不受重視的轉錄延伸步驟也存在高度有序，極為精細的調控機制，這主要得益于正性轉錄延伸因子b(positive-transcription elongation factorb，P-TEFb)的發(fā)現(xiàn)及對其功能的研究。P-TEFb復合體是由激酶CDK9(Cyclin dependent kinase)及其調節(jié)亞基Cy

2、cT1(Cyclin T1)組成的異二聚體，其功能是作為基礎轉錄延伸因子在轉錄延伸過程中通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ大亞基CTD上的第2位絲氨酸來克服負性延伸因子對轉錄延伸的抑制作用，從而刺激轉錄延伸，保證全長mRNA的合成。在生物體內，P-TEFb復合體具有廣泛功能，其不僅參與調控與細胞增殖、胚胎發(fā)育及免疫應激相關的基因轉錄表達，更是HIV-1轉錄復制過程中所必需的宿主細胞因子之一。
　　在對P-TEFb復合體的生物學功能及其活性調

3、控機制的不斷探索中，研究人員逐步發(fā)現(xiàn)多個由P-TEFb復合體參與的結構組分，并對P-TEFb復合體的網絡組成已有較為全面的認識。這些結構組分包括:(1)由7SK snRNA、HEXIM1、MePCE、LARP7和P-TEFb組成的7SK snRNP;(2)由AFF1/4、ELL1/2、ENL/AF9和P-TEFb組成的SEC復合體;(3)由Brd4和P-TEFb組成的復合體。但對于P-TEFb復合體行使其生物學功能最關鍵的環(huán)節(jié)之一，即如

4、何在多個結構組分之間形成相互轉換缺乏重視和了解。
　　本論文闡釋AFF1參與調控HIV-1 Tat蛋白介導的P-TEFb復合體活化并對其分子機制展開研究，發(fā)現(xiàn)AFF1廣泛參與P-TEFb復合體的網絡組成并通過兩條途徑激活Tat轉錄活性。首先，我們發(fā)現(xiàn)AFF1不僅作為骨架蛋白參與形成SEC復合體，還存在于P-TEFb網絡的另外兩個組分7SK snRNP和Brd4復合體中，提示其可能參與P-TEFb的活性調控。進一步研究發(fā)現(xiàn)，7SK

5、snRNP和Brd4復合體中的其他亞基并不與AFF1發(fā)生直接相互作用，而是通過P-TEFb橋接作用與AFF1發(fā)生聯(lián)系。同時，在壓力刺激下，AFF1-CDK9-CycT1可以作為一個獨立的亞復合體單位參與從7SK snRNP復合體到Brd4復合體的轉換，暗示其參與壓力響應過程。
　　在探索AFF1的功能時，我們發(fā)現(xiàn)AFF1可以顯著增強Tat與CycT1的結合能力。因此，含有AFF1的7SK snRNP復合體可以優(yōu)先被Tat識別并通過

6、與HEXIM1的直接競爭解離7SK snRNP，完成對P-TEFb的招募。此外，通過對AFF1突變體的研究，我們發(fā)現(xiàn)當Tat只能招募P-TEFb但不能形成完整SEC復合體時，其轉錄激活活性明顯降低。我們的研究表明AFF1廣泛參與P-TEFb網絡的形成，并通過協(xié)同作用促進Tat對P-TEFb的招募并最終導致7SK snRNP復合體的解離。此外，通過AFF1介導的Tat-SEC復合體的形成則首次從分子水平上證明了SEC對Tat轉錄激活活性的