AFF1在P-TEFb網(wǎng)絡(luò)中的功能研究.pdf

1、在真核細(xì)胞中，編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)通過一系列復(fù)雜有序的調(diào)控機(jī)制完成的。不斷深入的研究表明過去不受重視的轉(zhuǎn)錄延伸步驟也存在高度有序，極為精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，這主要得益于正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b(positive-transcription elongation factorb，P-TEFb)的發(fā)現(xiàn)及對其功能的研究。P-TEFb復(fù)合體是由激酶CDK9(Cyclin dependent kinase)及其調(diào)節(jié)亞基Cy

2、cT1(Cyclin T1)組成的異二聚體，其功能是作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄延伸因子在轉(zhuǎn)錄延伸過程中通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ大亞基CTD上的第2位絲氨酸來克服負(fù)性延伸因子對轉(zhuǎn)錄延伸的抑制作用，從而刺激轉(zhuǎn)錄延伸，保證全長mRNA的合成。在生物體內(nèi)，P-TEFb復(fù)合體具有廣泛功能，其不僅參與調(diào)控與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育及免疫應(yīng)激相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，更是HIV-1轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中所必需的宿主細(xì)胞因子之一。
　　在對P-TEFb復(fù)合體的生物學(xué)功能及其活性調(diào)

3、控機(jī)制的不斷探索中，研究人員逐步發(fā)現(xiàn)多個(gè)由P-TEFb復(fù)合體參與的結(jié)構(gòu)組分，并對P-TEFb復(fù)合體的網(wǎng)絡(luò)組成已有較為全面的認(rèn)識。這些結(jié)構(gòu)組分包括:(1)由7SK snRNA、HEXIM1、MePCE、LARP7和P-TEFb組成的7SK snRNP;(2)由AFF1/4、ELL1/2、ENL/AF9和P-TEFb組成的SEC復(fù)合體;(3)由Brd4和P-TEFb組成的復(fù)合體。但對于P-TEFb復(fù)合體行使其生物學(xué)功能最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，即如

4、何在多個(gè)結(jié)構(gòu)組分之間形成相互轉(zhuǎn)換缺乏重視和了解。
　　本論文闡釋AFF1參與調(diào)控HIV-1 Tat蛋白介導(dǎo)的P-TEFb復(fù)合體活化并對其分子機(jī)制展開研究，發(fā)現(xiàn)AFF1廣泛參與P-TEFb復(fù)合體的網(wǎng)絡(luò)組成并通過兩條途徑激活Tat轉(zhuǎn)錄活性。首先，我們發(fā)現(xiàn)AFF1不僅作為骨架蛋白參與形成SEC復(fù)合體，還存在于P-TEFb網(wǎng)絡(luò)的另外兩個(gè)組分7SK snRNP和Brd4復(fù)合體中，提示其可能參與P-TEFb的活性調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，7SK

5、snRNP和Brd4復(fù)合體中的其他亞基并不與AFF1發(fā)生直接相互作用，而是通過P-TEFb橋接作用與AFF1發(fā)生聯(lián)系。同時(shí)，在壓力刺激下，AFF1-CDK9-CycT1可以作為一個(gè)獨(dú)立的亞復(fù)合體單位參與從7SK snRNP復(fù)合體到Brd4復(fù)合體的轉(zhuǎn)換，暗示其參與壓力響應(yīng)過程。
　　在探索AFF1的功能時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)AFF1可以顯著增強(qiáng)Tat與CycT1的結(jié)合能力。因此，含有AFF1的7SK snRNP復(fù)合體可以優(yōu)先被Tat識別并通過

6、與HEXIM1的直接競爭解離7SK snRNP，完成對P-TEFb的招募。此外，通過對AFF1突變體的研究，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)Tat只能招募P-TEFb但不能形成完整SEC復(fù)合體時(shí)，其轉(zhuǎn)錄激活活性明顯降低。我們的研究表明AFF1廣泛參與P-TEFb網(wǎng)絡(luò)的形成，并通過協(xié)同作用促進(jìn)Tat對P-TEFb的招募并最終導(dǎo)致7SK snRNP復(fù)合體的解離。此外，通過AFF1介導(dǎo)的Tat-SEC復(fù)合體的形成則首次從分子水平上證明了SEC對Tat轉(zhuǎn)錄激活活性的