基于親和純化-質(zhì)譜定量分析P-TEFb調(diào)控HIV-1基因轉(zhuǎn)錄蛋白-蛋白相互作用研究.pdf

1、艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一種以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的嚴重傳染性疾病。2008年法國科學家Francoise Barré-Sinoussi和Luc Montagnier因發(fā)現(xiàn)HIV病毒及其病理獲得了諾貝爾生理與醫(yī)學獎。艾滋病已經(jīng)奪取了全球幾千萬人的生

2、命，并且現(xiàn)在還有四千多萬的攜帶者，但到目前為止仍沒有任何一種治療策略能夠治愈艾滋病，如何阻止和根除HIV是擺在人類面前的巨大挑戰(zhàn)。許多科學問題需要迫切地研究，尤其是在HIV感染宿主細胞的過程中，HIV與宿主細胞之間的相互作用分子機制是治療HIV的關鍵，通過對HIV與宿主細胞之間的相互作用分子機制研究并最終找到根除HIV的治療方法。
　　在HIV-1轉(zhuǎn)錄復制過程中，P-TEFb是所必需的宿主細胞因子之一。P-TEFb是由CDK9(C

3、yclin denpendent kinase9)及其調(diào)節(jié)亞基Cyclin T1組成的異源二聚體激酶，在HIV基因轉(zhuǎn)錄延伸過程中可磷酸化RNA polⅡ最大亞基上第二位絲氨酸，并克服負性延伸因子對轉(zhuǎn)錄延伸的抑制作用，從而保證全長mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　本文采用不同的HIV激活因子(HIV Tat、JQ1)以及P-TEFb的抑制劑(I-CDK9)來激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄，運用定量蛋白質(zhì)組學(quantitative proteomic

4、s)的方法來檢測在HIV轉(zhuǎn)錄復制過程中以P-TEFb為核心的蛋白復合物的動態(tài)變化。在穩(wěn)定整合HIV-1 LTR Luciferase的HeLa細胞為模型的基礎上，構建了N1F9（穩(wěn)定表達Flag-CDK9）穩(wěn)定細胞株，運用親和純化-高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用分析(AP-MS/MS)和穩(wěn)定同位素氨基酸標記質(zhì)譜定量技術（SILAC）。我們研究發(fā)現(xiàn):(1)在轉(zhuǎn)染Tat后，LARP7、MePCE和Hexim1都降低，AF9、ENL、AFF1和AFF4都

5、增加，這意味著Tat能使P-TEFb從7SK snRNP中解離，Tat募集SEC復合物到HIV基因的啟動子上，從而利于HIV基因的轉(zhuǎn)錄。同時，還檢測到了另外一個P-TEFb復合物降低10倍。(2)在經(jīng)過JQ1處理后，發(fā)現(xiàn)7SK snRNP和SEC都沒有明顯變化，而另外一個P-TEFb復合物（即上文提到的P-TEFb復合物）增加15倍，這個復合物在HIV-Tat存在下降低非常明顯，而在JQ1處理下增加非常明顯，提示其在HIV轉(zhuǎn)錄復制過程發(fā)

6、揮著重要功能，其具體的分子機制是什么我們正在研究。(3)在經(jīng)過P-TEFb抑制劑I-CDK9處理后，LARP7、MePCE和Hexim1都降低，其他復合物沒有什么變化，提示I-CDK9能造成7SKsnRNP解離，但并不能引起全局性的基因轉(zhuǎn)錄。
　　綜上，本文采用定量蛋白質(zhì)組學并聯(lián)合AP-MS/MS的方法，系統(tǒng)地研究了以P-TEFb為核心的HIV基因轉(zhuǎn)錄過程中的蛋白復合物的動態(tài)變化，證實P-TEFb以及P-TEFb的復合物在HIV-