小關(guān)節(jié)切除導(dǎo)致的頸椎間盤(pán)退變和骨質(zhì)疏松對(duì)其影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　椎間盤(pán)退變是一種普遍存在的疾病，是造成肩頸痛和腰痛的主要病因，嚴(yán)重的影響人們的生活質(zhì)量。老齡化是椎間盤(pán)退變的一個(gè)重要因素，在60歲以上的人群中，有60-80％在影像學(xué)上出現(xiàn)骨贅、椎間隙狹窄。椎間盤(pán)退變作為一系列脊柱退行性變疾病的前提和病理基礎(chǔ)，對(duì)脊柱疾病發(fā)生發(fā)展的研究至關(guān)重要。造成椎間盤(pán)退變的機(jī)制包括脊柱異常的生物力學(xué)、椎間盤(pán)組織細(xì)胞的改變以及椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)的異常。脊柱的穩(wěn)定性與椎間盤(pán)受到異常機(jī)械負(fù)荷密切相關(guān)，是造成

2、椎間盤(pán)退變的因素之一。穩(wěn)定脊柱的結(jié)構(gòu)分為被動(dòng)穩(wěn)定子系統(tǒng)和主動(dòng)穩(wěn)定子系統(tǒng)，被動(dòng)穩(wěn)定子系統(tǒng)包括椎體、椎間盤(pán)以及韌帶，而主動(dòng)穩(wěn)定子系統(tǒng)包括脊柱的周?chē)∪狻?br>　　骨質(zhì)疏松也是一種年齡相關(guān)性疾病，尤其是絕經(jīng)后的女性最為明顯。骨質(zhì)疏松是由于骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)的丟失而引起的骨組織微結(jié)構(gòu)退變的疾病。在絕經(jīng)后的女性人群中，雌激素缺乏引起骨組織微結(jié)構(gòu)的改變可能是造成骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要因素。脊柱退行性變與骨質(zhì)疏松都是年齡相關(guān)的疾患，都會(huì)導(dǎo)致生活質(zhì)量下降，

3、增加傷殘率和死亡率，兩者之間存在緊密的聯(lián)系，臨床上常見(jiàn)患者同時(shí)罹患這兩種疾病，而這兩者之間相互作用仍不確定。
　　為了探究?jī)烧咧g的關(guān)系，本課題組前期制備了頸背部肌肉切除造成脊柱動(dòng)靜力失衡的大鼠頸椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型，觀察到典型的椎間盤(pán)退變，并同時(shí)制備了骨質(zhì)疏松復(fù)合椎間盤(pán)退變的復(fù)合模型，觀察到骨質(zhì)疏松可能通過(guò)影響軟骨終板來(lái)加重椎間盤(pán)退變。該模型通過(guò)切除主動(dòng)穩(wěn)定脊柱的肌肉來(lái)造成椎間盤(pán)退變，觀察到典型的退變的現(xiàn)象。但是，動(dòng)靜力失衡模型

4、會(huì)造成頸椎長(zhǎng)節(jié)段的退變且節(jié)段位置與臨床不同，無(wú)法模擬臨床上常見(jiàn)節(jié)段退變。
　　切除頸背部肌肉破壞主動(dòng)穩(wěn)定脊柱系統(tǒng)能造成頸椎間盤(pán)退變，是否破壞脊柱被動(dòng)的穩(wěn)定系統(tǒng)也能造成椎間盤(pán)退變呢？因此，本研究切除頸椎小關(guān)節(jié)，破壞頸椎被動(dòng)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)來(lái)觀察是否同樣能夠造成椎間盤(pán)退變，同時(shí)觀察在復(fù)合骨質(zhì)疏松的情況下，能否加重椎間盤(pán)退變，并進(jìn)一步對(duì)椎間盤(pán)組織生物化學(xué)方面指標(biāo)進(jìn)行研究。最后，本研究通過(guò)補(bǔ)充雌激素來(lái)驗(yàn)證骨質(zhì)疏松對(duì)椎間盤(pán)退變的影響是否由雌激素缺乏

5、引起。
　　目的:
　　1.建立雙側(cè)小關(guān)節(jié)切除的大鼠頸椎間盤(pán)退變模型，對(duì)切除節(jié)段軟骨終板的形態(tài)、椎體骨小梁的微結(jié)構(gòu)、椎間盤(pán)組織學(xué)及生物化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià);
　　2.探討在骨質(zhì)疏松情況下雙側(cè)小關(guān)節(jié)切除節(jié)段椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。
　　方法:
　　1.雙側(cè)小關(guān)節(jié)切除大鼠頸椎間盤(pán)退變模型的建立。
　　選取28只3月齡的雌性SD大鼠，體重230±20g，將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組（16只）和對(duì)照組（12只），分籠飼養(yǎng)。模型

6、組切除C4/5和C5/6雙側(cè)關(guān)節(jié)突，肌肉不予切除。對(duì)照組僅切開(kāi)皮膚，暴露關(guān)節(jié)突后直接縫合。于術(shù)后12、24周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別獲取大鼠頸5/6節(jié)段和頸4/5椎間盤(pán)組織。對(duì)C5/6節(jié)段進(jìn)行顯微CT掃描、番紅O固綠染色。對(duì)C4/5椎間盤(pán)組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)情況行RT-PCR檢測(cè)。測(cè)量C5/6椎間高度，并計(jì)算該節(jié)段上、下軟骨終板的磨損面積，并對(duì)C5/6椎間盤(pán)組織進(jìn)行退變程度評(píng)分。測(cè)定C4/5椎間盤(pán)組織中蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型膠原

7、(Col2α1)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)3表達(dá)水平。
　　2.建立椎間盤(pán)退變復(fù)合骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型，探討在骨質(zhì)疏松情況下椎間盤(pán)退變的進(jìn)程。
　　另外選取44只3月齡的雌性SD大鼠，分為3組，加上前面2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為5組:對(duì)照組（12只）、單純骨質(zhì)疏松組（12只）、單純退變組（16只）、骨質(zhì)疏松復(fù)合退變組（16只）和復(fù)合組雌激素補(bǔ)充組（16只），以研究骨質(zhì)疏松對(duì)椎間盤(pán)退變的影響。通過(guò)切除頸4/5和頸5/6雙側(cè)小關(guān)節(jié)制備椎

8、間盤(pán)退變模型。通過(guò)切除雙側(cè)卵巢來(lái)制備骨質(zhì)疏松模型。結(jié)合椎間盤(pán)退變和骨質(zhì)疏松模型制備復(fù)合組。雌激素補(bǔ)充組則是在復(fù)合組的基礎(chǔ)上，通過(guò)皮下注射雌二醇來(lái)補(bǔ)充雌激素。分別于術(shù)后12和24周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取大鼠頸5/6節(jié)段和頸4/5椎間盤(pán)組織。顯微CT掃描方法同上。對(duì)C5/6節(jié)段，行石蠟包埋切片，番紅O快綠染色及Aggrecan、Col2α1和MMP-3免疫組化染色。對(duì)C4/5椎間盤(pán)組織行Aggrecan、Col2α1和MMP-3的PCR檢測(cè)。

9、>　　結(jié)果:
　　1.小關(guān)節(jié)切除后頸椎間盤(pán)的退變。
　　1.1 椎間高度、軟骨終板和骨微結(jié)構(gòu)的改變
　　在12周時(shí)，雙側(cè)小關(guān)節(jié)切除后椎間高度的明顯下降，較對(duì)照組降低0.4 mm，而在24周時(shí)，高度下降更加顯著，兩者間差異為0.6mm。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差異具有顯著性(P＜0.05)。12周時(shí)，雙側(cè)小關(guān)節(jié)切12周時(shí)除造成C5/6椎間盤(pán)上、下兩個(gè)軟骨終板明顯的磨損，并且在24周更加嚴(yán)重，兩者間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

10、
　　在12周時(shí)，模型組C5椎體骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和骨小梁間隙(Tb.Sp)與對(duì)照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)，而骨小梁的厚度(Tb.Th)和骨小梁數(shù)目(Tb.N)較對(duì)照組有上升趨勢(shì)，但兩者間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。而在24周時(shí)，模型組BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp較對(duì)照組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。說(shuō)明雙側(cè)小關(guān)節(jié)切除在早期能夠使切除節(jié)段椎體骨小梁的數(shù)目增加、骨小梁厚度變厚、骨小梁間隙變窄，增加了

11、椎體的骨體積分?jǐn)?shù)，而到了后期骨小梁變化與對(duì)照組無(wú)明顯差別。
　　1.2 椎間盤(pán)組織學(xué)觀察及其退變?cè)u(píng)分
　　在12周時(shí)，模型組椎間盤(pán)的軟骨終板形態(tài)不規(guī)則、出現(xiàn)缺損及少許鈣化，髓核細(xì)胞出現(xiàn)聚集、數(shù)量減少和纖維環(huán)排列紊亂;而24周時(shí)，模型組軟骨終板出現(xiàn)明顯的缺損和和鈣化，髓核細(xì)胞數(shù)目顯著減少、聚集，纖維化出現(xiàn)較多的裂隙和斷裂。椎間盤(pán)退變?cè)u(píng)分較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，在12周時(shí)模型組和對(duì)照組的評(píng)分分別為7.1±1.3分和5.

12、3±0.5分，而24周時(shí)分別為9.9±1.9分和6.2±1.2分，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其退變?cè)u(píng)分越高。
　　1.3 椎間盤(pán)組織RT-PCR檢測(cè)
　　在12周時(shí)，模型組C4/5椎間盤(pán)組織Aggrecan、Col2α1的表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)，僅為對(duì)照組的0.45倍和0.44倍。而模型組中MMP-3也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)，為對(duì)照組的1.23倍。而24周時(shí)，其各項(xiàng)退變指標(biāo)較對(duì)照組均出現(xiàn)顯著差異(P＜0

13、.05)。
　　2.骨質(zhì)疏松對(duì)椎間盤(pán)退變的影響。
　　在12周時(shí)，單純骨質(zhì)疏松組和復(fù)合組C5椎體均出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松，即在卵巢切除的大鼠中，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp均有骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)，較未切除卵巢組有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明在卵巢切除12周時(shí)，大鼠頸椎出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松。而在雌激素補(bǔ)充組中，BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp的變化較單純骨質(zhì)疏松組及復(fù)合組均有顯著性差異(P＜0.05)，而與對(duì)

14、照組和單純退變組差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明大鼠雙側(cè)卵巢切除后補(bǔ)充17-β雌二醇能有效的緩解卵巢切除導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。
　　2.1 軟骨終板形態(tài)和椎間高度的改變
　　單純退變組、復(fù)合組和雌激素補(bǔ)充組C5/6椎間盤(pán)上、下軟骨終板均出現(xiàn)明顯缺損，下終板主要以腹側(cè)磨損為主，而上終板磨損區(qū)域出現(xiàn)在正中及四周，且其磨損面積隨時(shí)間的延長(zhǎng)加重，復(fù)合組的磨損率在不同時(shí)間點(diǎn)較單純退變組均明顯升高(P＜0.05)。復(fù)合組與雌激素補(bǔ)充組之間有顯

15、著性差異(P＜0.05)，而雌激素補(bǔ)充組與單純退變組之間差異不顯著(P＞0.05)。
　　2.2 椎間盤(pán)組織學(xué)觀察及其退變?cè)u(píng)分
　　與單純退變組相比，復(fù)合組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上軟骨終板形態(tài)、磨損情況及髓核和纖維環(huán)退變程度均較嚴(yán)重。雌激素補(bǔ)充組與單純退變組變化不明顯。從椎間盤(pán)退變?cè)u(píng)分來(lái)看，在12周時(shí)，復(fù)合組與單純退變組之間差異不明顯(P＞0.05)，兩者評(píng)分分別為8.3±1.3分和7.1±1.3分，但與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

16、0.05)。而24周時(shí)，復(fù)合組為11.6±1.9分，單純退變組為9.9±1.9分，對(duì)照組為6.2±1.2分，兩兩間均出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05)，復(fù)合組退變?cè)u(píng)分明顯升高。雌激素補(bǔ)充組與單純退變組的趨勢(shì)相似，兩者間無(wú)顯著性差異。
　　2.3 椎間盤(pán)組織免疫組織化學(xué)
　　在12周時(shí)，髓核組織中，單純退變組與復(fù)合組Aggrecan和Col2α1的染色強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，且與單純退變組相比，復(fù)合組的染色強(qiáng)度更低;而MMP-3的染色強(qiáng)

17、度在單純退變組和復(fù)合組中明顯強(qiáng)于對(duì)照組，復(fù)合組染色強(qiáng)度最高;雌激素補(bǔ)充組，Aggrecan、Col2α1和MMP-3的染色強(qiáng)度與單純退變組相似。而在24周時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，且差異更加明顯。
　　2.4 椎間盤(pán)組織RT-PCR檢測(cè)
　　在12周時(shí)，Aggrecan的RT-PCR結(jié)果，單純退變組僅為對(duì)照組的0.54，而復(fù)合組為對(duì)照組的0.35;在Col2α1的表達(dá)中，單純退變組為對(duì)照組的0.26，復(fù)合組為對(duì)照組的0.1