Caveolin-1對EGFR突變陽性肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的影響.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率一直位居首位的惡性腫瘤。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌總數(shù)的85％左右，而肺腺癌是其中最常見的病理類型。盡管肺癌的早期檢測有了巨大的提升，但大部分患者被確診時已屬于肺癌晚期，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。
　　表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）在40%-80%的NSCLC中呈現(xiàn)過表達，其同源或

2、異源二聚體化和自身磷酸化都會激活下游的MAPK和PI3K信號通路，從而引起細胞過度生長，生存和轉(zhuǎn)移。以EGFR為靶點的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosin kinase inhibitors， TKIs）可通過與ATP競爭性結(jié)合EGFR酪氨酸激酶域從而抑制腫瘤細胞的生長。因此，EGFR-TKIs已成為EGFR突變陽性的肺腺癌治療的有效手段。且有研究證實腫瘤細胞中EGFR-TKIs的敏感性和EGFR基因的突變類型相關(guān)，其敏感突變?yōu)?9外顯子缺

3、失突變（delE746-A750）、18外顯子點突變（L858R）和21外顯子點突變（G719S）。因此，EGFR-TKIs已成為EGFR敏感突變型晚期NSCLC患者的一線用藥方案。然而， EGFR-TKIs療效存在明顯的個體差異，約25%帶有EGFR敏感突變類型的患者對EGFR-TKIs不敏感或治療無反應(yīng)，即發(fā)生原發(fā)耐藥。而且即使對EGFR-TKIs治療起初有效的患者，其臨床療效也不盡一致，且最終都不可避免的出現(xiàn)獲得性耐藥。雖然針對E

4、GFR突變本身（T790M）、EGFR通路相關(guān)分子（c-MET擴增）以及其他通路分子的研究已部分證實均和EGFR-TKIs耐藥有關(guān)，但尚不足解釋EGFR-TKIs在EGFR基因突變肺腺癌患者中的療效差異。
　　小凹蛋白（Caveolin-1，Cav-1）是細胞質(zhì)膜表面特異性膜內(nèi)陷囊泡的重要標志性結(jié)構(gòu)蛋白，分子量21-24kDa。Cav-1可以通過其微囊中的腳手架結(jié)合域和許多信號蛋白結(jié)合（EGFR、ErbB2、H-Ras、MEK等）

5、從而影響和調(diào)控其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進而導(dǎo)致細胞一系列生物學(xué)行為的改變。許多研究證實Cav-1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。我們的前期實驗也已證實，在肺腺癌細胞中，Cav-1通過影響EGFR的磷酸化調(diào)節(jié)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等能力。另外，有研究顯示Cav-1與腫瘤細胞的多藥耐藥和對化療藥的敏感性有關(guān)，且在許多耐藥的腫瘤細胞中Cav-1呈現(xiàn)高表達。但目前為止關(guān)于Cav-1是否影響分子靶向藥的敏感性尚未見

6、報道。
　　本研究通過臨床結(jié)合細胞學(xué)體內(nèi)外實驗研究以期明確（1）Cav-1表達量是否與肺腺癌對EGFR-TKIs的敏感性有關(guān)。（2）Cav-1影響肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的分子機制。為臨床解釋EGFR-TKIs療效的個體差異提供可能的理論依據(jù)，為臨床精準選擇EGFR-TKIs藥物提供新的生物標記物，為臨床研發(fā)克服EGFR-TKIs耐藥的新藥提供新靶點。
　　第一部分：Caveolin-1在EGFR突變陽性晚期肺腺癌組織

7、中的表達及其與吉非替尼療效的相關(guān)性研究
　　目的：明確Cav-1在EGFR突變陽性晚期肺腺癌組織中的表達以及探討其與吉非替尼療效的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.臨床標本
　　選取中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院2011年7月-2014年7月收治的接受吉非替尼一線治療的EGFR突變陽性（19外顯子缺失突變）的晚期（IIIB或IV期）肺腺癌患者標本20例。近期療效評判標準按照實體腫瘤療效評價標準（Response E

8、valuation Criteria in Solid Tumors, RECIST1.1），分為完全緩解（Complete Response, CR）、部分緩解（Partial Response, PR）、疾病穩(wěn)定（Stable Disease, SD）和疾病進展（Progressive Disease, PD）。遠期療效為無疾病進展時間（Progression Free Survival, PFS）和總生存期（Overall Sur

9、vival, OS）。
　　2.免疫組化
　　將福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊制成5μm的連續(xù)切片，孵育Cav-1和Ki-67抗體后進行免疫染色。免疫組化的結(jié)果由兩位有經(jīng)驗的病理科大夫利用雙盲法進行評分。采用H指數(shù)分析Cav-1表達情況可綜合考慮染色強度和密度，其中染色強度分為0-3四個等級；染色密度有低至高分別記為0-100。最終H指數(shù)由以下公式計算得出：H指數(shù)=(染色強度為1細胞面積%×1)+(染色強度為2細胞面積%×2)

10、+(染色強度為3細胞面積%×3)。Ki-67陽性信號為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細小顆粒，計數(shù)500個腫瘤細胞中陽性細胞所占百分比來計算平均陽性率。
　　結(jié)果：
　　1.Cav-1在肺腺癌組織中的表達
　　光鏡下觀察Cav-1染色情況，可見其分布于細胞膜和細胞漿，而Ki-67分布于細胞核。通過H評分和線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中，Cav-1表達與Ki-67表達呈正相關(guān)（r=0.71;P<0.05）。
　　2.高表達C

11、av-1預(yù)示吉非替尼療效不佳及PFS較短
　　根據(jù)患者的病理特征分組分析發(fā)現(xiàn)，這些病理特征與Cav-1的表達水平并無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但根據(jù)吉非替尼治療的疾病反應(yīng)率、PFS和OS分組的分析發(fā)現(xiàn)，其與Cav-1的表達水平均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。經(jīng)吉非替尼治療后，所有患者的總緩解率達60%，且（CR+PR）組的病人中Cav-1的評分明顯低于（SD+PD）組。此外，所有患者的中位PFS為8個月（95%CI:6.910

12、-9.090），且患者PFS較短的分組中Cav-1的評分明顯高于PFS較長組；所有患者的中位OS為16.5個月（95%CI:13.578-19.422），且患者OS較短的分組中Cav-1的評分明顯高于OS較長組。以所有患者組織標本中Cav-1評分的中位數(shù)為截斷值，將患者分為Cav-1高表達組和低表達組。通過分析發(fā)現(xiàn)，Cav-1高表達組中患者的總緩解率明顯低于Cav-1低表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Cav-1高表達組中患者

13、的PFS明顯短于Cav-1低表達組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而兩組間的OS并無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　第二部分：敲低 Caveolin-1的表達對 EGFR突變陽性肺腺癌細胞EGFR-TKIs敏感性的影響
　　目的：探討敲低Cav-1的表達對EGFR突變陽性肺腺癌細胞EGFR-TKIs敏感性的影響。
　　方法：
　　1.細胞轉(zhuǎn)染
　　選取對EGFR-TKIs敏感的中量表達Cav-1的P

14、C-9細胞，分別轉(zhuǎn)染Control shRNA或Cav-1 shRNA質(zhì)粒，嘌呤霉素進行抗性篩選，構(gòu)建正常表達Cav-1的PC-9/Ctrl和低表達Cav-1的PC-9/KD細胞。
　　2.增殖抑制實驗
　　將細胞接種于96孔板，過夜貼壁后分別用不同濃度的EGFR-TKIs（吉非替尼和厄洛替尼）處理，培養(yǎng)一定的時間后上機檢測吸光度值（OD）。半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentrati

15、on, IC50）定義為細胞抑制達50%時的藥物濃度。而后，以每對轉(zhuǎn)染細胞中較低的IC50來處理細胞，檢測不同時間點（24h、48h、72h）的細胞抑制率。
　　3.克隆形成實驗
　　克隆形成實驗是以一種細胞不相互接觸的方式來檢測細胞增殖快慢的實驗。細胞以低密度接種，300個/培養(yǎng)皿，在有或無EGFR-TKIs的環(huán)境中培養(yǎng)，8-12天后可觀察到肉眼可見的克隆，蘇木素染色后進行計數(shù)。
　　4.劃痕實驗
　　將細胞接

16、種于24孔板，過夜貼壁后形成單細胞層，移液器槍頭進行劃痕，在有或無EGFR-TKIs的環(huán)境中培養(yǎng)，不同時間點進行拍照直到劃痕愈合。
　　5.侵襲實驗
　　將稀釋后的基質(zhì)膠鋪于小室的上室，當膠凝固后加入有或無EGFR-TKIs處理的細胞，下室加入適量完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，將穿膜的細胞進行HE染色，顯微鏡下拍照和計數(shù)。
　　6.蛋白印跡
　　將有或無EGFR-TKIs處理的細胞裂解和定量后，10%SDS-

17、PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1h，最后ECL試劑盒進行顯色。
　　7.免疫共沉淀
　　將裂解后的細胞蛋白分別用抗EGFR和抗Cav-1的抗體進行免疫沉淀，4℃過夜孵育。然后在每管樣品中加入40?l蛋白G瓊脂糖微珠，4℃滾動混勻2h。蛋白印跡分別檢測蛋白裂解液和免疫沉淀復(fù)合物中EGFR和Cav-1蛋白的表達。
　　8.激光共聚焦
　　將細胞接種到提前置入

18、蓋玻片的培養(yǎng)皿中，4%多聚甲醛固定20min，0.1%TritonX-100透化10min，8%BSA封閉1h，抗Cav-1和抗EGFR抗體同時加到載玻片上4℃過夜孵育，熒光二抗Alexa Flour488羊抗鼠 IgG和Alexa Flour555羊抗兔IgG同時加到載玻片上37℃避光孵育1h。DAPI染核室溫避光孵育5min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照9體內(nèi)實驗
　　5周齡裸鼠右背部皮下接種細胞，每周測量瘤徑,計

19、算腫瘤體積：瘤體積=1/2×長徑×短徑2。當瘤體積達40mm3時，將各組裸鼠分別分為加藥組（吉非替尼6mg/kg）和不加藥組（相同體積的滅菌水）。灌胃4周后脫頸處死裸鼠，稱量瘤重并計算抑瘤率。每只裸鼠的瘤組織用于后續(xù)蛋白印跡和免疫組織化學(xué)
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建
　　PC-9/KD細胞中Cav-1的相對表達量明顯低于PC-9親本株和PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實：敲低

20、Cav-1表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。
　　2.敲低Cav-1的表達增強PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法檢測Cav-1表達對PC-9細胞EGFR-TKIs敏感性的影響，結(jié)果顯示：在不同濃度EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼， PC-9/KD細胞的生長抑制率明顯高于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨濃度的遞增，細胞的生長抑制率也增加。PC-9/KD細胞的IC50

21、值明顯低于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在不同時間點（24h、48h、72h）作用下，PC-9/KD細胞的生長抑制率同樣明顯高于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨著時間點的延長，細胞的生長抑制率也增加。結(jié)果證實：EGFR-TKIs對PC-9的抑制作用具有時效性和量效性；敲低Cav-1表達增強PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性。
　　3.敲低Cav-1的表達抑制PC-9細胞的

22、增殖、遷移和侵襲，增強EGFR-TKIs對細胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)
　　無EGFR-TKIs作用時，PC-9/KD細胞的克隆形成率明顯低于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/KD細胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯強于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時，PC-9/KD細胞的劃痕愈合時間明顯長

23、于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼， EGFR-TKIs對PC-9/KD細胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯強于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時，PC-9/KD細胞的穿膜數(shù)明顯少于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/KD

24、細胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯強于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實：敲低Cav-1表達抑制PC-9細胞的增殖、遷移和侵襲，增強EGFR-TKIs對其抑制的效應(yīng)。
　　4.敲低Cav-1的表達通過抑制EGFR的活化增強PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性
　　無EGFR-TKIs作用時，PC-9/KD細胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相對水平明顯低于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著

25、性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/KD細胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表達水平的抑制效應(yīng)明顯強于PC-9/Ctrl細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。免疫共沉淀實驗證實Cav-1和EGFR可以直接結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞膜和細胞漿處紅色區(qū)域代表Cav-1表達，綠色區(qū)域代表EGFR表達，將兩者merge后的黃色代表Cav-1和EGFR共定位。結(jié)果

26、證實：敲低Cav-1表達降低PC-9細胞中MAPK和PI3K信號通路活化蛋白的表達，增強EGFR-TKIs敏感性。
　　5.敲低Cav-1的表達抑制裸鼠腫瘤組織的生長
　　PC-9/KD組裸鼠腫瘤體積明顯小于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）；PC-9/KD組裸鼠腫瘤重量明顯輕于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）。
　　6.敲低Cav-1的表達增強肺腺癌腫瘤組織對吉非替尼的敏感性

27、r>　　在吉非替尼灌胃2周后， PC-9/KD組的裸鼠腫瘤體積開始縮小，而PC-9/Ctrl組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長的趨勢，差異均有顯著性（P<0.05）。PC-9/KD組的抑瘤率明顯大于PC-9/Ctrl組，差異均有顯著性（P<0.05）。Western blot實驗檢測Cav-1表達對瘤組織中MAPK和PI3K信號通路蛋白表達的影響，結(jié)果同體外實驗一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：PC-9/KD組中Cav-1和Ki-67的表達水平明顯低

28、于PC-9/Ctrl組；無吉非替尼作用時，Cav-1的表達水平與Ki-67存在正相關(guān)；有吉非替尼作用時，Ki-67的表達水平明顯下降。
　　第三部分：過表達Caveolin-1對EGFR突變陽性肺腺癌細胞EGFR-TKIs敏感性的影響
　　目的：探討過表達Cav-1對EGFR突變陽性肺腺癌細胞EGFR-TKIs敏感性的影響。
　　方法：
　　1.細胞轉(zhuǎn)染
　　選取對EGFR-TKIs敏感的中量表達Cav-1

29、的PC-9細胞，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3.1/Cav-1質(zhì)粒，G418進行抗性篩選，構(gòu)建正常表達Cav-1的PC-9/pcDNA3.1和過表達Cav-1的PC-9/Cav-1細胞。
　　2.其余方法同第二部分。
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建
　　PC-9/Cav-1細胞中Cav-1的相對表達量明顯高于PC-9親本株和PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實

30、：過表達Cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。
　　2.過表達Cav-1降低PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法檢測Cav-1表達對PC-9細胞EGFR-TKIs敏感性的影響，結(jié)果顯示：在不同濃度EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼， PC-9/Cav-1細胞的生長抑制率明顯低于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨濃度的遞增，細胞的生長抑制率也增加。PC-9/Ca

31、v-1細胞的IC50值明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在不同時間點（24h、48h、72h）作用下， PC-9/Cav-1細胞的生長抑制率同樣明顯低于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05），且隨著時間點的延長，細胞的生長抑制率也增加。結(jié)果證實：EGFR-TKIs對PC-9的抑制作用具有時效性和量效性；過表達Cav-1降低PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性。
　　

32、3.過表達Cav-1促進PC-9細胞的增殖、遷移和侵襲，降低EGFR-TKIs對細胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)
　　無EGFR-TKIs作用時， PC-9/Cav-1細胞的克隆形成率明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/Cav-1細胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均具有顯著性（P<0.0

33、5）。無EGFR-TKIs作用時， PC-9/Cav-1細胞的劃痕愈合時間明顯短于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/Cav-1細胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。無EGFR-TKIs作用時，PC-9/Cav-1細胞的穿膜數(shù)明顯多于PC-9/pcDNA3.1細胞，差

34、異均具有顯著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼，EGFR-TKIs對PC-9/Cav-1細胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均具有顯著性（P<0.05）。結(jié)果證實：過表達Cav-1可以增強PC-9細胞的生物學(xué)行為，減弱EGFR-TKIs對其抑制的效應(yīng)。
　　4.過表達Cav-1通過調(diào)控EGFR的活化降低PC-9細胞對EGFR-TKIs的敏感性
　　無EGFR

35、-TKIs作用時， PC-9/Cav-1細胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相對水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用時，無論吉非替尼還是厄洛替尼， EGFR-TKIs對PC-9/Cav-1細胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表達水平的抑制效應(yīng)明顯弱于PC-9/pcDNA3.1細胞，差異均有顯著性（P<0.05）。免疫共沉淀實驗證實Cav-1和EGFR可以直接

36、結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞膜和細胞漿處紅色區(qū)域代表Cav-1表達，綠色區(qū)域代表EGFR表達，將兩者merge后的黃色代表Cav-1和EGFR共定位。結(jié)果證實：過表達Cav-1促進PC-9細胞中MAPK和PI3K信號通路活化蛋白的表達，減弱EGFR-TKIs敏感性。
　　5.過表達Cav-1促進裸鼠腫瘤組織的生長
　　PC-9/Cav-1組裸鼠腫瘤體積明顯大于PC-9/pcDNA3.1組，差異均有顯著性（P<0.05）

37、；PC-9/Cav-1組裸鼠腫瘤重量明顯重于PC-9/pcDNA3.1組，差異均有顯著性（P<0.05）。
　　6.過表達Cav-1降低肺腺癌腫瘤組織對吉非替尼的敏感性
　　在吉非替尼灌胃2周后，PC-9/Cav-1組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長的趨勢，而PC-9/pcDNA3.1組的裸鼠腫瘤體積呈穩(wěn)定不變或緩慢縮小的趨勢，差異均有顯著性（P<0.05）。PC-9/Cav-1組的抑瘤率明顯小于PC-9/pcDNA3.1組，差異均

38、有顯著性（P<0.05）。Western blot實驗檢測Cav-1表達對瘤組織中MAPK和PI3K信號通路蛋白表達的影響，結(jié)果同體外實驗一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：PC-9/Cav-1組中Cav-1和Ki-67的表達水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1組；無吉非替尼作用時，Cav-1的表達水平與Ki-67存在正相關(guān)；有吉非替尼作用時，Ki-67的表達水平明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.Cav-1表達水平與肺腺癌EGFR-