氨基脲對斑馬魚(Danio rerio)的抗雌激素效應機制研究.pdf

1、近年來，新型污染物氨基脲(semicarbazide，SEM)主要存在于嬰兒食品、果汁、果醬、蜜餞等日常食品中，而在液體牛奶、面粉等食品中也檢出氨基脲殘留。2009年9月我國東營潮河入海口及鄰近海域海水的氨基脲含量高達46.41μg/L，貝類等生物體內氨基脲平均含量為3.14～6.46μg/kg，超過歐盟對動物源性食品中氨基脲殘留的限量值1.0μg/kg。由此可見，氨基脲不但威脅人類的食品安全，也對我國海洋生態(tài)環(huán)境造成了嚴重危害。已有的

2、研究發(fā)現(xiàn)，氨基脲在哺乳動物和魚體內發(fā)揮潛在的抗雌激素效應，例如降低雌性大鼠血漿E2水平，抑制雌性斑馬魚肝臟中雌激素受體(estrogen receptorα，ERα)基因和卵黃原蛋白1(vitellogenin-1，vtg-1)基因的表達，但是氨基脲發(fā)揮以上抗雌激素效應的機制尚不明確。因此，本文采用氨基脲暴露性成熟的成年斑馬魚，以斑馬魚性腺組織性激素含量為指標，明確氨基脲在成年斑馬魚體內是否通過拮抗17β-雌二醇(17β-estradi

3、ol，E2)水平發(fā)揮抗雌激素效應;其次在類固醇合成酶的基因表達水平以及下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad axis，HPG軸)對E2的調控兩方面從E2合成的角度探究氨基脲對斑馬魚的抗雌激素效應機制。
　　本研究結果表明:
　　(1)1μg/L、10μg/L、100g/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d，采用同位素放射免疫分析法(radioimmunoassa

4、y，RIA)檢測斑馬魚性腺中性激素含量，結果表明:96h的暴露實驗發(fā)現(xiàn)，卵巢E2水平在10μg/L濃度組出現(xiàn)極顯著降低;28d的暴露結果顯示，雌魚卵巢E2水平在1μg/L氨基脲濃度組顯著降低。另外，本實驗室另一位博士生的研究結果發(fā)現(xiàn)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d能夠抑制血漿中E2水平。因此我們認為氨基脲主要是通過抑制雌性斑馬魚卵巢內E2的合成，拮抗E2水平，發(fā)揮抗雌激素效

5、應。
　　(2)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d，采用實時定量PCR檢測類固醇合成關鍵酶P450scc、P450c17、3β-HSD、P450aromA的基因表達量變化，結果表明:96h的暴露結果表明，1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露對卵巢3β-HSD1、P450c17、P450scc的表達均未產(chǎn)生顯著影響，P450aromAmRN

6、A表達水平在1、10、100μg/L濃度組顯著降低;28d的暴露結果顯示，卵巢P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表達水平與對照組相比在不同濃度組均表現(xiàn)出不同程度降低，而3β-HSD1基因表達量無顯著變化。因此，我們認為氨基脲能夠下調雌魚卵巢細胞色素氧化酶的表達(主要是作用于限速酶P450aromA)，抑制卵巢E2的合成。此外，E2與1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲聯(lián)合暴露成年雄性斑

7、馬魚96h/28d的結果表明:96h的聯(lián)合暴露實驗結果表明，氨基脲與E2聯(lián)合暴露相比E2單獨處理組主要在不同濃度降低類固醇合成酶基因P450aromA、P450sccmRNA表達水平。氨基脲與E2聯(lián)合暴露雄性斑馬魚28d的結果顯示，與E2單獨處理組相比，E2與氨基脲的聯(lián)合暴露能夠在不同濃度下降低P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表達水平。聯(lián)合暴露的實驗結果表明，氨基脲主要是通過拮抗外源添加E2在成年雄性斑馬魚體內

8、引起的芳香化酶表達量的上調，進而發(fā)揮抗雌激素效應。
　　(3)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d，采用實時定量PCR檢測HPG軸上調控E2合成的相關因子FSHβ、LHβ、sGnRH、P450aromB基因表達量，結果表明:96h/28d的結果顯示，1μg/L、10μg/L氨基脲暴露顯著降低雌性斑馬魚腦中sGnRH、FSHβ基因表達量。因此，我們認為氨基脲通過下調下丘腦s

9、GnRH的表達降低垂體中FSHβmRNA的表達水平，進而抑制芳香化酶的活性。此外，E2與1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L的氨基脲聯(lián)合暴露成年雄性斑馬魚96h/28d的結果顯示:96h的暴露實驗發(fā)現(xiàn)，E2與1μg/L、10μg/L氨基脲聯(lián)合暴露相比E2單獨處理組顯著降低sGnRHmRNA的表達水平;28d的結果顯示，與E2單獨處理組相比，E2與1μg/L氨基脲聯(lián)合暴露導致雄性斑馬魚腦中FSHβ、LHβ、sGnRH

10、mRNA的表達水平較E2單獨處理組均顯著降低，因此我們認為氨基脲主要是通過拮抗外源添加E2在成年雄性斑馬魚腦中引起的sGnRH、FSHβ表達量的上調，發(fā)揮其抗雌激素效應。
　　綜上，通過我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，氨基脲發(fā)揮抗雌激素效應的機制是通過抑制斑馬魚下丘腦中HPG軸起始因子sGnRH的表達，進一步下調垂體FSHmRNA的表達水平，進而抑制卵巢中細胞色素氧化酶P450家族(主要是P450aromA)基因表達量，最終抑制卵巢E2的合成