雙酚A對斑馬魚(Danio rerio)雌激素效應(yīng)的DNA甲基化機(jī)制研究.pdf

1、雙酚A是世界上產(chǎn)量最大的化學(xué)品之一，在水環(huán)境中的濃度能夠達(dá)到21～1730μg/L，對水生生物和生態(tài)系統(tǒng)的健康具有潛在的風(fēng)險。研究表明雙酚A等環(huán)境雌激素主要通過與雌激素受體(estrogen receptors，ERs)結(jié)合或干擾內(nèi)源雌激素水平兩種途徑發(fā)揮雌激素效應(yīng)，這兩種途徑均涉及多種基因表達(dá)水平的紊亂，但雙酚A干擾基因表達(dá)的深層分子機(jī)制并不清楚。本研究采用500～1500μg/L雙酚A暴露斑馬魚21d或全世代(15～150dph)，

2、以血漿17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)水平、雄魚肝臟卵黃原蛋白(vitellogenin，VTG)合成、F1代繁殖能力及子代發(fā)育水平、F1代性別比例為指標(biāo)，在分子、細(xì)胞和個體水平系統(tǒng)研究了雙酚A對斑馬魚的雌激素效應(yīng)，并從靶器官ERs基因和性腺E2合成相關(guān)基因表達(dá)的角度闡述了雙酚A雌激素效應(yīng)的分子機(jī)制;為進(jìn)一步研究雙酚A改變基因表達(dá)水平的作用機(jī)理，本研究對組織gDNA和基因CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行了檢測，從DNA甲基化

3、調(diào)控基因表達(dá)的角度深入探討了雙酚A發(fā)揮雌激素效應(yīng)的機(jī)制。研究結(jié)果表明:
　　(1)雙酚A暴露21d，500和1500μg/L雙酚A暴露顯著升高雄魚血漿E2含量、1000μg/L雙酚A顯著降低E2含量，雙酚A全世代(15～150dph)暴露后，各暴露組雌魚血漿E2含量無顯著變化、雄魚血漿E2含量在1000μg/L暴露組顯著升高;暴露21d，雄魚肝臟vtg1 mRNA水平和VTG蛋白含量在500和1500μg/L暴露組顯著升高，在10

4、00μg/L暴露組無顯著變化;全世代暴露后，500～1500μg/L雙酚A均顯著升高F1代雌魚卵巢閉鎖卵泡比例，1000和1500μg/L雙酚A顯著降低F1代雌魚平均產(chǎn)卵量和F2代72hpf孵化率、顯著升高F2代12hpf死亡率;500～1500μg/L雙酚A暴露全世代均顯著升高了雌魚比例。雙酚A暴露增加了雄魚血漿E2含量、誘導(dǎo)了雄魚肝臟VTG的合成、抑制了親代繁殖和子代發(fā)育水平，并誘導(dǎo)了雌雄性別比例失調(diào)，能夠?qū)Π唏R魚產(chǎn)生多種雌激素效應(yīng)

5、。
　　(2)雙酚A暴露21d，雄魚肝臟ERα基因表達(dá)水平僅在1000μg/L暴露組顯著升高，ERβ1基因表達(dá)水平在各個暴露組均顯著升高，ERβ2基因表達(dá)水平無顯著變化。暴露21d，1000和1500μg/L暴露組精巢star和cyp17a1 mRNA水平顯著降低，500～1500μg/L暴露組cyp19a1amRNA水平均顯著升高;雙酚A全世代暴露后，500μg/L暴露組雌魚卵巢star mRNA水平顯著升高，500～1500μ

6、g/L暴露組卵巢cyp19a1amRNA水平均顯著降低，而雄魚精巢cyp11a1在500μg/L暴露組顯著降低，cyp17a1 mRNA水平在1000和1500μg/L暴露組顯著升高，cyp19a1amRNA水平僅在1000μg/L暴露組顯著升高。結(jié)果表明雙酚A主要通過影響肝臟ERα和EEβ1基因、性腺cyp19a1a基因的表達(dá)干擾靶器官ERs的響應(yīng)和性腺E2的合成。
　　(3)500～1500μg/L雙酚A暴露21d，1000和

7、1500μg/L暴露組雄魚肝臟gDNA甲基化水平顯著降低，1000μg/L暴露組ERα基因5'側(cè)翼區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平、以及500μg/L暴露組vtg1基因CpG1691的甲基化水平均顯著降低;暴露21d，雄魚精巢gDNA甲基化水平無顯著變化，1000μg/L暴露組cyp19a1a基因5'側(cè)翼區(qū)CpG79和CpG114的甲基化水平顯著降低;全世代暴露后，1000和1500μg/L暴露組雌魚卵巢gDNA甲基化水平顯著升高，500～150

8、0μg/L暴露組雌魚卵巢cyp19a1a基因5'側(cè)翼區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平均有所升高，但與對照相比變化并不顯著。對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(dnmts)和甘氨酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(gnmt)表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)雙酚A暴露21d顯著促進(jìn)了雄魚肝臟和精巢dnmts基因的表達(dá)，全世代暴露顯著抑制了雌魚卵巢dnmts基因的表達(dá)，dnmts表達(dá)水平的變化與DNA甲基化水平的變化并不一致;暴露21d，500～1500μg/L暴露組雄魚肝臟gnmt

9、mRNA水平顯著升高。雙酚A能夠通過降低或升高性腺cyp19a1a基因DNA甲基化水平上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)，肝臟ERα基因和vtg1基因的表達(dá)也受到DNA甲基化的調(diào)控，但雙酚A改變DNA甲基化水平的機(jī)制比較復(fù)雜，肝臟組織DNA甲基化水平的降低與gnmt基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
　　綜上，本研究結(jié)果表明500～1500μg/L雙酚A暴露21d或全世代后，能夠升高雄魚血漿E2含量、誘導(dǎo)雄魚肝臟VTG合成、降低F1代繁殖能力及子代發(fā)育水平、造成F