肝損傷萃取物對不同物種BMSCs分化方向的影響及微囊包被技術初探.pdf

1、干細胞定向誘導分化是當前干細胞研究領域的一個熱點問題。骨髓間質細胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的均質性成體干細胞，在特定誘導條件下可向不同胚層的細胞分化，如：骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞、肝細胞等。近年來，向肝系細胞分化的研究越來越受到人們的關注。本實驗的前期研究已成功實現了由骨髓間質細胞向肝細胞的誘導分化，證實了肝損傷組織萃取物對骨髓干細胞的定向誘導活性，并初步揭示了肝損傷組織萃取物的分子基礎。研究顯示，肝損傷組織萃取

2、物內可能包含有骨髓間質細胞向肝細胞定向分化所需的信息分子。然而，上述研究都是以大鼠模型為基礎的，研究發(fā)現的大鼠肝損傷組織萃取物的生物學活性是否對其他物種也起作用?換言之，大鼠肝損傷組織萃取物的干細胞定向誘導活性是否具有物種廣譜性?對于評估肝損傷組織萃取物的潛在應用價值以及是否有進一步研究開發(fā)的必要性，無疑具有十分重要的意義。 如上所述，我們已實現了由骨髓間質細胞向肝細胞的誘導分化，并經動物實驗證明這些骨髓源肝細胞能夠代償衰竭的肝

3、臟功能，可作為細胞移植和生物反應器研制的細胞源。然而，如何解決免疫隔離問題則是我們必須跨越的技術屏障。文獻分析顯示，ACA微囊比較適合細胞移植和生物反應器對免疫隔離的要求。因此，能否利用海藻酸鈉和殼聚糖等材料成功地制作出ACA微囊、微珠等細胞載體?能否實現微囊/微珠與細胞的成功結合?如何提高微囊/微珠內細胞的存活率并保持其生物活性?若能解決這一系列技術問題，對于細胞移植技術的發(fā)展及生物反應器的研制無疑具有十分重要的意義。基于目前的研究現

4、狀以及本研究組前期的工作結果，本實驗擬采用大鼠肝損傷組織萃取物分別對源自大鼠、人和新西蘭兔的BMSCs進行誘導分化，以觀察不同物種來源的細胞對大鼠肝損傷組織萃取物的應答能力，從而判斷大鼠肝損傷組織萃取物對骨髓間質細胞的誘導活性是否具有物種廣譜性。同時，為了解決細胞移植所引起的免疫隔離問題我們初步探索了．ACA微囊/微珠技術，為細胞移植技術的發(fā)展及生物反應器的研制做必要的準備。 實驗方法： 一、肝損傷萃取物對不同物種BMS

5、Cs分化方向的影響： 1.肝損傷大鼠模型的構建及肝組織萃取物的制備選取SD大鼠為實驗動物，以2-AAF/CCl4程序構建肝損傷動物模型。取動物肝臟，制備肝組織萃取物。 2.肝組織萃取物生物活性的鑒定以肝組織萃取物作為刺激物對大鼠骨髓間質細胞(BMSCs)進行體外誘導分化實驗，根據BMSCs誘導前后的形態(tài)學特征以及分子表達譜特征(分化狀態(tài))確認肝組織萃取物的生物活性。 3.三個物種BMSCs的獲取和培養(yǎng)。

6、4.利用同批次相同誘導強度的肝損傷萃取物誘導液同時對三個不同物種的BMSCs進行誘導培養(yǎng)。 5.分別在第5、7、10和20天收集誘導中的細胞，并拍照記錄下不同時間的形態(tài)特征。 6.利用RT—PCR技術分析不同物種在不同誘導時間的分子表達譜。 二、微囊包被技術初步探索： 1.利用自制微囊制備儀制備微載體，在倒置相差顯微鏡下觀察微載體的形態(tài)。 2.掃描電鏡觀察微球和微珠表面超微結構。 3.嘗試

7、模擬滾動培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)載細胞微珠，并觀察不同培養(yǎng)方式下微珠內細胞生長活性和細胞形態(tài)。 實驗結果： 1.三個物種BMSCs在誘導過程中形態(tài)學變化十分相似。在誘導的第5天見一部分短梭形細胞變?yōu)轭悎A形細胞(圖3—4)，且細胞生長速度明顯減慢；誘導第10天，類圓形細胞逐漸變?yōu)槎嘟切晤惿掀有螒B(tài)，細胞灶狀分布逐漸凸顯，導第20天，灶狀分布的類上皮樣細胞十分明顯，呈簇狀緩慢生長，中央區(qū)域細胞多角形明顯(人BMSCs變化更為明顯)。

8、 2.大鼠、人和新西蘭兔BMSCs在肝損傷組織萃取物的誘導下第5天開始表達幼稚肝細胞的標記M2-PK和GST-P，而在繼續(xù)誘導第20天幼稚肝細胞的標記消失，同時大鼠BMSCs轉而開始表達成熟肝細胞標記Albumin；在第10、20天骨髓源性標記BST-1逐漸消失。這種分化跡象從始至終在對照組沒有發(fā)現，并始終保持骨髓源細胞特有的標志分子BST-1。注：新西蘭兔則因基因信息缺乏致數據缺失。 3.微珠/微囊大小均一、平均直徑為0

9、.8mm左右，規(guī)則圓形，表面光滑，透明，并具有一定強度；載細胞微珠形態(tài)大小和表面結構與空載微珠完全相同，但微珠內可見分布均勻的細胞；載細胞微囊為大小均勻，平均直徑約為1m，規(guī)則圓形，囊壁完整；培養(yǎng)24h后載細胞微囊內壁可見貼壁細胞貼于微囊囊壁生長，貼壁細胞形態(tài)與生長活性和培養(yǎng)瓶二維培養(yǎng)細胞基本相同。 4.掃描電鏡示：500倍下微球表面凹凸不平伴有圓形突起，突起之間的平坦區(qū)為表面平滑的皺褶，100000倍下皺褶表面平滑。殼聚糖外膜

10、的微珠500倍下可見粗糙表面伴有凹凸不平的球形隆起，100000倍下每個大顆粒表面為分布均勻的形狀大小均細的珊瑚狀或小顆粒結構組成。 5.微珠在靜置培養(yǎng)5天后仍保持一定存活率，同種培養(yǎng)方式下，細胞存活率的下降趨勢是固定的，滾動培養(yǎng)在短時間內可以保持較高的存活率；使用培養(yǎng)基更適合做靜置培養(yǎng)。載細胞微囊靜置培養(yǎng)10天后仍保持較強存活率。 結論： 1.使用大鼠肝損傷萃取物同時對大鼠、人和新西蘭兔BMSCs的誘導實驗發(fā)現

11、，三個物種的BMSCs均能對大鼠肝損傷萃取物的誘導刺激作出應答反應，分別在刺激的第5，7，10天表達幼稚肝細胞的分子標志M2-PK和GST-P(新西蘭兔BMSCs僅表達M2-PK)。表明大鼠肝損傷萃取物對骨髓干細胞定向分化的誘導活性具有物種廣譜性，有必要進一步研究開發(fā)。 2.由于誘導實驗的各項參數是依據大鼠設定，誘導實驗的第20天，僅見大鼠BMSCs表達albumin，人BMSCs未見表達，可能與刺激強度不足或刺激時間不夠所致。

12、新西蘭兔則因albumin基因信息缺乏致數據缺失。 3.以自制微囊制備儀制作的海藻酸鈉微球、ACA微珠和ACA微囊直徑在0.8mm左右，大小均一，形狀規(guī)則，超微結構特點明顯，初步達到預期目標。 4.ACA．微珠/微囊與細胞結合實驗顯示，細胞能在微珠內存活7天左右而在微囊可以存活10天以上。表明ACA微珠和微囊具有較好的半透性，可作為細胞載體。 5.自制微囊制備儀制作的ACA微珠和微囊直徑偏大，表面積較小，距實際應