CORIN3’UTR基因多態(tài)性與心血管疾病相關(guān)性及miR-302c結(jié)合CORIN3’UTR調(diào)控Corin表達(dá)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)和心房顫動(atrial fibrillation，AF)是心血管領(lǐng)域的常見病和多發(fā)病，目前認(rèn)為EH和AF是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用導(dǎo)致的多基因遺傳疾病:高鹽高脂飲食、吸煙、缺乏運(yùn)動、肥胖、糖尿病等環(huán)境因素已經(jīng)證實(shí)能夠促進(jìn)EH和AF的發(fā)生發(fā)展;利用家系連鎖分析的定位克隆方法在高血壓家系中發(fā)現(xiàn)MR、WNK4、AME、NR3C2、KLHL3和CUL3等單基

2、因突變;在AF家系中發(fā)現(xiàn)SCN5A、SCN10A、KCNQ1和NPPA等單基因突變。但絕大多數(shù)的EH/AF患者為散發(fā)人群且EH/AF屬于復(fù)雜性疾病，這種情況下通過家系連鎖分析尋找復(fù)雜性疾病的致病基因非常困難。
　　全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)是應(yīng)用人類基因組中上百萬的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)為標(biāo)記進(jìn)行病

3、例-對照關(guān)聯(lián)分析，以期發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性疾病發(fā)生的遺傳特征的一種新策略。目前利用GWAS已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)EH/AF易感位點(diǎn)和易感基因:ATP2B1、CYP17A1、P EKHA7、H2B3、TBX3-TBX5、ACNB2、MTHFR、ANF652、NPPA、CDH13、RYR2等基因多態(tài)位點(diǎn)與EH相關(guān);染色體4q25、ZFHX3、NPPA、1q21等基因多態(tài)位點(diǎn)與AF相關(guān)。
　　Corin是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)特異性表達(dá)于心臟的絲氨酸蛋白酶，我們

4、利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測可能特異性識別CORIN基因3'UTR的miRNA并驗(yàn)證該miRNA是否能夠調(diào)控Corin表達(dá)。
　　方法:
　　本研究為病例-對照研究，連續(xù)收集2012年12月-2014年3月就診于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的EH、AF和對照個(gè)體外周靜脈血，碘化鉀法提取基因組DNA，并利用高分辨率熔解曲線技術(shù)(high-resolution melting，HRM)對CORIN基因3' UTR區(qū)域4個(gè)SNPs位點(diǎn)——r

5、s3749585、rs3749584、rs4695253和rs12641823進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各SNP三種基因型在EH組、AF組與對照組分布，以及不同遺傳模式下與EH和AF發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測AF組和對照組血漿可溶性Corin和NT-proANP水平;通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-302c可能特異性靶向識別CORIN3'

6、 UTR，將miR-302c轉(zhuǎn)染至人心肌細(xì)胞株，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA和免疫印跡法檢測miR-302c對內(nèi)源性Corin表達(dá)調(diào)控;構(gòu)建CORIN-3' UTR-psiCHECK2雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，將miR-302c與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞，通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測miR-302c對CORIN-3' UTR特異性靶向識別和調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.在中國東北地區(qū)漢族人群中，存在CORIN3'U

7、TR rs3749585、rs3749584、rs4695253和rs12641823多態(tài)性。
　　2.EH-對照研究共納入EH組患者1332例，對照組1552例;rs3749585在EH組CC、CT、TT基因型頻率分別為24.9％、52.2％、22.90％，對照組分別為29.90％、47.49％、22.62％;等位基因模式下兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.041)，且OR值為0.897，提示微小位點(diǎn)C高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，是EH的保護(hù)位點(diǎn)

8、，校正年齡、性別、AF、心力衰竭(heart failure，HF)和2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)等因素后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P-adj=0.032，OR=0.865);加性和隱性遺傳模式下校正因素前后P值均＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.rs4695253在EH組CC、CT、TT基因型頻率分別為72.6％、24.32％、3.08％，對照組分別為74.74％、23.90％、1.35％;等位

9、基因模式下兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.036)，且OR值=1.172，提示微小位點(diǎn)T高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，是EH的危險(xiǎn)位點(diǎn);隱性遺傳模式下校正因素前后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P-adj=0.001，OR=2.919)。
　　4.rs3749584和rs12641823三種基因型在EH組和對照組分布相似，等位基因和三種基因型遺傳模式下兩組校正因素前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）。
　　5.對EH組患者進(jìn)行LVH亞組分析，其中EH-LV

10、H組403例，EH-非LVH組929例;rs3749585顯性遺傳模式下兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)，且OR值為0.745，提示微小位點(diǎn)C高血壓LVH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，是LVH的保護(hù)位點(diǎn)，校正年齡、性別、AF、HF和T2DM等因素后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P-adj=0.034，OR=0.744); rs4695253隱性遺傳模式下校正因素后兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.033)，微小位點(diǎn)T高血壓中LVH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，是LVH的危險(xiǎn)位點(diǎn);rs3749

11、584和rs12641823三種基因型在兩組分布相似，等位基因和三種基因型遺傳模式下兩組校正因素前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）。
　　6.AF-對照研究共納入AF組患者539例，對照組2535例;rs3749585在AF組CC、CT、TT基因型頻率分別為29.68％、49.54％、20.78％，對照組分別為27.65％、49.39％、22.96％;等位基因、加性和隱性遺傳模式下校正年齡、性別、EH、LVH、HF和T2DM等

12、因素后兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P-adj=0.025、0.023和0.014），且OR值均大于1，提示微小位點(diǎn)C房顫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，是AF的危險(xiǎn)位點(diǎn)。
　　7.rs3749584在AF組CC、CG、GG基因型頻率分別為10.95％、25.6％、63.45％，對照組分別為0.51％、22.52％、74.28％;等位基因和三種基因型遺傳模式下兩組校正因素前后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＜0.001），且OR值均大于1，提示rs3749584與AF發(fā)生

13、顯著相關(guān)并且微小位點(diǎn)C是AF發(fā)生危險(xiǎn)位點(diǎn)。
　　8.rs4695253和rs12641823三種基因型在AF組和對照組分布相似，等位基因模式和三種基因型遺傳模式下兩組校正因素前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）。
　　9.AF患者血漿可溶性Corin水平顯著高于對照組(1209±510 vs.973±528 pg/ml，P＜0.001);分別對兩組進(jìn)行性別亞組分析，發(fā)現(xiàn)AF組和對照組男性血漿Corin水平均高于女性(AF組

14、:1365±485 vs.842±358 pg/ml，P＜0.001;對照組:1120±577 vs.713±218 pg/ml，P＜0.001);AF組患者血漿NT-proANP水平顯著高于對照組(3.1±2.42 vs.1.77±1.04 nmol/1，P＜0.001)。
　　10.miR-302c轉(zhuǎn)染組AC16細(xì)胞內(nèi)源性CORIN mRNA和Corin蛋白表達(dá)較miR-NC轉(zhuǎn)染組明顯降低(P＜0.001);ELISA檢測mi

15、R-302c轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裂解液Corin濃度為0.60±0.072 ng/ml，顯著低于miR-NC轉(zhuǎn)染組0.79±0.030 ng/ml(P＜0.001)。
　　11.與miR-NC+CORIN-3' UTR-psiCHECK2轉(zhuǎn)染組相比，miR-302c+CORIN-3' UTR-psiCHECK2轉(zhuǎn)染組雙熒光素酶表達(dá)活性顯著降低(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.在中國東北漢族人群中，存在CORIN基因3'U

16、TR區(qū)域rs3749585、rs3749584、rs4695253和rs12641823多態(tài)性。
　　2.rs3749585與EH//LVH發(fā)生相關(guān)且CC基因型EH/LVH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，C位點(diǎn)是EH/LVH的保護(hù)位點(diǎn)。
　　3.rs4695253與EH發(fā)生相關(guān)且TT基因型EH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，T位點(diǎn)是EH危險(xiǎn)位點(diǎn);但rs4695253與LVH發(fā)生不相關(guān)。
　　4.rs3749584和rs12641823與EH/LVH發(fā)生不相關(guān)

17、。
　　5.rs3749585與AF發(fā)生相關(guān)且CC基因型AF發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，C位點(diǎn)是AF的危險(xiǎn)位點(diǎn)。
　　6.rs3749584與AF發(fā)生顯著相關(guān)且CC基因型AF發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，C位點(diǎn)是AF危險(xiǎn)位點(diǎn)。
　　7.rs4695253和rs12641823與AF發(fā)生不相關(guān)。
　　8.AF患者血漿可溶性Corin水平顯著升高，可能是AF的新型生物標(biāo)記物。
　　9.miR-302c能夠下調(diào)AC16細(xì)胞內(nèi)源性CORINmRNA