肌腱鈣化的相關(guān)研究.pdf

1、肌腱鈣化為臨床中常見(jiàn)疾病，常并發(fā)于肌腱損傷或手術(shù)之后，或作為肌腱病的一種特殊表現(xiàn)形式。本課題旨在對(duì)肌腱鈣化的發(fā)病機(jī)制及防治做一從基礎(chǔ)到臨床相關(guān)的系統(tǒng)性研究。旨在提高對(duì)于肌腱鈣化的基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)，從而指導(dǎo)臨床治療。
　　第一章 肌腱鈣化動(dòng)物模型的建立及驗(yàn)證
　　目的:評(píng)價(jià)跟腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型是否穩(wěn)定可靠，為之后采用該模型進(jìn)行研究提供依據(jù)。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無(wú)菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，

2、暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術(shù)后放回籠中自由活動(dòng)。術(shù)后10周時(shí)處死小鼠行小動(dòng)物CT檢測(cè)鈣化體積。并行HE及阿爾新藍(lán)染色明確組織學(xué)變化。
　　結(jié)果:術(shù)后1周時(shí)跟腱中段可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少數(shù)肌腱細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)較少。術(shù)后4周時(shí)，炎性細(xì)胞基本消失，取而代之的為大量肌腱細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)較1周時(shí)明顯增加，但細(xì)胞及新生肌腱結(jié)構(gòu)排列紊亂。術(shù)后6周時(shí)，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)較繼續(xù)增加，但細(xì)胞及新生肌腱結(jié)構(gòu)仍

3、排列紊亂。術(shù)后10周時(shí)，可見(jiàn)較為完整的肌腱結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)明顯增加，細(xì)胞及新生肌腱結(jié)構(gòu)排列整齊。
　　結(jié)論:通過(guò)組織學(xué)觀察證實(shí)了跟腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化為典型的插入部肌腱鈣化，且其病理過(guò)程為軟骨內(nèi)成骨。本研究通過(guò)比較4組小鼠術(shù)后10周肌腱鈣化的體積大小發(fā)現(xiàn)各組間骨化體積大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明跟腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型穩(wěn)定且重復(fù)性好，可繼續(xù)用于之后的各項(xiàng)研究。
　　第二章 肌腱鈣化進(jìn)行性發(fā)展并影響肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度
　　目的

4、:對(duì)肌腱鈣化定性，明確其是否為進(jìn)展性疾病，并明確肌腱鈣化是否影響肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無(wú)菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術(shù)后放回籠中自由活動(dòng)。術(shù)后10周及6個(gè)月時(shí)處死小鼠行小動(dòng)物CT檢測(cè)鈣化體積并行生物力學(xué)測(cè)試。同時(shí)行HE及阿爾新藍(lán)染色明確組織學(xué)變化。
　　結(jié)果:μCT結(jié)果顯示術(shù)后10周及6個(gè)月時(shí)，手術(shù)側(cè)肌腱均發(fā)生肌腱鈣化，鈣

5、化位于肌腱的骨-腱結(jié)合側(cè)及肌腱-肌肉結(jié)合處。術(shù)后10周及六個(gè)月時(shí)在肌腱的骨-腱結(jié)合處均發(fā)現(xiàn)了骨化組織，在骨化區(qū)周?chē)橛写罅寇浌菢蛹?xì)胞且可以被阿爾新藍(lán)陽(yáng)染。在肌肉-肌腱結(jié)合側(cè)我們發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象。
　　結(jié)論:通過(guò)觀察造模后10周及6個(gè)月小鼠的鈣化體積及生物力學(xué)變化，我們發(fā)現(xiàn)肌腱鈣化為進(jìn)展性疾病且損害肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度，未來(lái)探索預(yù)防肌腱鈣化的藥物尤為必要。
　　第三章 損傷源性肌腱祖細(xì)胞的提取及相關(guān)研究
　　目的:明確肌腱損傷后

6、參與肌腱鈣化發(fā)生的干/祖細(xì)胞，為預(yù)防肌腱鈣化提供新的細(xì)胞水平治療靶點(diǎn)。
　　方法:將小鼠行跟腱切斷后1周安樂(lè)死后取其跟腱，將肌腱充分切碎，加入肌腱消化液，置于37℃水浴中震蕩消化1小時(shí)。將分離下來(lái)的細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察克隆形成，進(jìn)行干細(xì)胞鑒定并行多能分化誘導(dǎo)。將小鼠安樂(lè)死后取其跟腱，消化后提取肌腱干/祖細(xì)胞，并行與上述損傷肌腱相同處理。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)10天后，我們對(duì)克隆形成數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)

7、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從正常肌腱及損傷后肌腱中提取的細(xì)胞均可以形成克隆。但從損傷后肌腱中提取的細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯多于正常肌腱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（正常肌腱:0.
　　結(jié)論:本研究中我們采用跟腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型進(jìn)行研究，在肌腱損傷后1周提取新生肌腱的局部細(xì)胞。我們的結(jié)果表明:肌腱損傷后，局部含有一種獨(dú)特的細(xì)胞群，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞表現(xiàn)出克隆形成能力、自我更新及多向分化潛能等干細(xì)胞的普遍特性，并表達(dá)干細(xì)胞表面抗原。我們將這一獨(dú)特的損傷后

8、肌腱來(lái)源的細(xì)胞群命名為損傷源性肌腱祖細(xì)胞。損傷源性肌腱祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為今后探索肌腱鈣化的發(fā)生機(jī)制及探索新的治療方式提供了細(xì)胞水平靶點(diǎn)。
　　第四章 以損傷源性肌腱祖細(xì)胞為治療靶點(diǎn)的藥物探索
　　目的:以損傷源性肌腱祖細(xì)胞為細(xì)胞水平靶點(diǎn)，探索潛在的可以抑制肌腱鈣化的藥物。
　　方法:將小鼠行安樂(lè)死后取其跟腱，將肌腱充分切碎，加入肌腱消化液，置于37℃水浴中震蕩消化1小時(shí)。將分離下來(lái)的細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后至P

9、3代。成骨及成軟骨培養(yǎng)體系下評(píng)價(jià)LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來(lái)昔布對(duì)損傷源性肌腱祖細(xì)胞成骨及成軟骨分化的影響。
　　結(jié)果:成軟骨培養(yǎng)體系中，LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來(lái)昔布均顯著降低阿爾新藍(lán)陽(yáng)性染色濃度(Control:1.0455±0.0469; LDN-193189:0.2628±0.0411; RAR-γagonist:0.3461±0.0364;

10、 GANT58:0.5378±0.0402;塞來(lái)昔布:0.7117±0.0199）（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）(F=338.262)(P＜0.0001)(n=4)。
　　結(jié)論:本研究以損傷源性肌腱祖細(xì)胞為細(xì)胞水平靶點(diǎn)，進(jìn)行了大量藥物的嘗試，試圖發(fā)現(xiàn)潛在的可以抑制肌腱鈣化的藥物。本部分結(jié)果表明:LDN-193189、RAR-γ agonist、GANT58及塞來(lái)昔布均顯著抑制損傷源性肌腱祖細(xì)胞的成骨及成軟骨分化，從而提示上述四種藥物可能為抑制肌

11、腱鈣化的潛在藥物。
　　第五章 體內(nèi)評(píng)價(jià)抑制肌腱鈣化的相關(guān)藥物
　　目的:采用跟腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)藥物預(yù)防肌腱鈣化的有效性。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無(wú)菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術(shù)后放回籠中自由活動(dòng)。術(shù)后予LDN-193189、NRX204647、GANT58及塞來(lái)昔布預(yù)防肌腱鈣化。術(shù)后10周處死小鼠行小動(dòng)物CT檢測(cè)鈣化

12、體積并于術(shù)后3周提取RNA評(píng)價(jià)藥物用于損傷肌腱的安全性。
　　結(jié)果:術(shù)后10周μCT結(jié)果顯示:LDN-193189(P＜0.0001)(n=5)、GANT58(P＜0.0001)(n=5)及Celecoxib(P＜0.0001)(n=5)均顯著降低肌腱鈣化的體積，RAR-γ agonist組肌腱鈣化體積與對(duì)照組相比差異不顯著(P=0.999)(n=5)（鈣化體積:Control:0.3763±0.1239 mm3;LDN-1931

13、89:0.0840±0.0095mm3;RAR-γ agonist:0.3856±0.1020mm3;GANT58:0.0250±0.0066 mm3;塞來(lái)昔布:0.0197±0.0122 mm3）（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）。
　　結(jié)論:本部分研究通過(guò)肌腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型評(píng)價(jià)LDN-193189、NRX204647、GANT58及塞來(lái)昔布四種藥物在預(yù)防肌腱鈣化中的作用。我們的結(jié)果表明LDN-193189、GANT58及塞來(lái)昔布均可有效

14、抑制肌腱鈣化的發(fā)生。我們進(jìn)一步比較各組肌腱相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果提示LDN-193189及GANT58可能影響肌腱的修復(fù)過(guò)程。因此，塞來(lái)昔布為抑制肌腱鈣化最為安全有效的藥物。
　　第六章 塞來(lái)昔布抑制肌腱鈣化的最佳治療時(shí)程
　　目的:本研究中我們將對(duì)塞來(lái)昔布抑制肌腱鈣化的最佳治療時(shí)程做一系統(tǒng)評(píng)估，探索保證其有效前提下的最短治療時(shí)程。
　　方法:采用C57小鼠，麻醉后在無(wú)菌條件下在右后跟處皮膚做一約1厘米的縱向切口，暴露肌膜

15、及跟腱。在跟腱中段橫斷跖肌腱及跟腱，縫合皮膚。術(shù)后放回籠中自由活動(dòng)。術(shù)后予塞來(lái)昔布2周、6周及10周預(yù)防肌腱鈣化。術(shù)后10周處死小鼠行小動(dòng)物CT檢測(cè)鈣化體積比較各組差異。
　　結(jié)果:術(shù)后10周μCT結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Celecoxib0-6周組(P＜0.0001)(n=5)及Celecoxib0-10周組(P＜0.0001)(n=5)均顯著降低肌腱鈣化的體積，Celecoxib0-2周組(P=0.459)(n=5)肌腱鈣化體

16、積與對(duì)照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（鈣化體積:Control:0.3969±0.1209mm3; Celecoxib0-2:0.3279±0.1202 mm3; Celecoxib0-6:0.0149±0.0071 mm3; Celecoxib0-10:0.0197±0.0122 mm3)（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）。
　　結(jié)論:本研究采用肌腱切斷誘導(dǎo)的肌腱鈣化模型，比較塞來(lái)昔布不同治療時(shí)程抑制肌腱鈣化的療效。結(jié)果表明:中長(zhǎng)期塞來(lái)昔布給藥可有