山茱萸不同栽培品種葉綠休DNA的SCAR標(biāo)記研究.pdf

1、山茉萸為山茱萸科(cornaceae)植物山茉萸(Cornus officinalis SiebZucc)除去果核的干燥成熟果肉，具有補益肝腎、澀精固脫等功效，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛等，為當(dāng)前大力發(fā)展的中藥材之一?，F(xiàn)代研究證明山茱萸具有較好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能和顯著的降血糖作用，因此中醫(yī)臨床用量較大；同時作為常用中成藥(如六味地黃丸等)原料，中藥生產(chǎn)用量也很大，主產(chǎn)于我國河南、陜西和浙江等省。我國學(xué)者根據(jù)山茉萸不同栽培品種果實的形狀、

2、大小、重量、顏色等對種內(nèi)性狀變異、類型劃分進(jìn)行了初步研究，分為橢圓形果型、長圓柱形果型、圓柱形果型、短圓柱形果型、長梨形果型、短梨形果型。國內(nèi)外對山茱萸的研究主要集中對其化學(xué)成分及藥理作用的研究，但沒有變異類型在cpDNA方面的深入研究，不利于山茱萸種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用，本實驗室己在DNA分子水平上建立了山茱萸各品種的RAPD指紋數(shù)據(jù)庫并成功獲得了山茉萸及其不同栽培品種的特異SCAR標(biāo)記，還獲得了山茱萸ITS完全序列。
　　

3、 葉綠體DNA種內(nèi)的多態(tài)性對以葉綠體DNA為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的建立有影響，特別對等級較低的分類單位(如種的水平)系統(tǒng)演化關(guān)系的建立影響特別顯著，不了解葉綠體DNA種內(nèi)差異是會得到不可靠的系統(tǒng)演化關(guān)系的。高等植物葉綠體DNA的保守性并非是絕對的，在較多類群里都有不同程度的葉綠體DNA種內(nèi)變異。因此，對cpDNA種內(nèi)變異的正確估計或了解是非常重要的。本實驗收集了河南、陜西等主產(chǎn)地山茉萸各品種的標(biāo)本共130份，提取其葉綠體DNA，并進(jìn)行RA

4、PD分析，主要結(jié)果如下：
　　 1.在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上，對提取條件進(jìn)行了改進(jìn)，該法從山茉萸葉片中提取的葉綠體DNA收率為351 μ g/ml～2049μ g/ml，經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測，紫外吸收檢測表明，提取的總DNA雜質(zhì)少且APD擴增效果良好。
　　 2.對RAPD擴增反應(yīng)體系和溫度循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化：(1)反應(yīng)體系：25 μ l反應(yīng)體系，其中10×bufer2.5μ1，Dntp(2.5mmol/L)3

5、.0μ1，Mg2+(25 mmool/L)3.0 μ1，引物(2μmol/L)3.0 μ 1，模板DNA(0.351 μ g/μ 1～2.049 μg/μ1)3.0μ1，Taq酶(5U/μ1)1μ1，去離子水9.5 μ1l。擴增產(chǎn)物在l×TAE的電泳緩沖液中用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓為每厘米3.4伏，電泳完畢用0.5 μg/ml的EB染色，拍照。
　　 (2)擴增程序：94℃預(yù)變性5 min，變性94℃，1 min；退火35

6、℃，1 min；延伸72℃，1 min；72℃5 mi。Ll補齊。其中變性94℃到退火35℃的降溫速度延長l min，退火35℃到延伸72℃的升溫速度延長1min，共35個循環(huán)。
　　 3.從100條上海生工S系列隨機引物和實驗室以前合成的W系列引物中篩選出15條擴增好，多態(tài)性穩(wěn)定的引物。將這些引物用于130份材料的擴增，擴增片段大小為200 bp～2000 bp。從1 5個引物產(chǎn)生的譜帶中共獲得57個位點，其中40個位點具有多

7、態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到70.18％，說明樣品具有很好的遺傳多樣性。
　　 本實驗以各樣本間的遺傳距離為聚類統(tǒng)計變量，采用SPSS16.0軟件計算DICE遺傳相似性系數(shù)，Between—groups Linkage方法聚類構(gòu)建親緣關(guān)系樹系圖。由聚類圖可以看到，紡錘形果型自成一類，其次是圓柱形果型和短圓柱形果型聚成一類，與另外幾種果型的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。長梨形果型和短梨形果型親緣關(guān)系較近，并且與親緣關(guān)系最近的長圓柱形果型和橢圓形果型聚成一類。

8、從樹狀圖也可以看出各栽培品種之間的遺傳關(guān)系，長圓柱形果型和橢圓形果型首先聚在一起，其次長梨形果型和短梨形果型聚在一起，接著這兩類合二為一，后與紡錘形果型合并，之后圓柱形果型和短圓柱形果型聚在一起，晟終和其他果型聚為一大類。實驗結(jié)果為山茉萸按照不同果型的分類提供了cpDNA分子水平的依據(jù)。
　　 4.從RAPD中篩選特異性的條帶進(jìn)行回收、克隆、測序，如ST479，根據(jù)測得的序列，用Primer Premierer(V5.0)設(shè)計了

9、5對SCAR特異性引物，經(jīng)過篩選得到結(jié)果的引物一共2對。用篩選出來的引物對山茱萸不同栽培品種及其同科植物、混偽品材料進(jìn)行擴增，經(jīng)過反復(fù)摸索實驗條件得到幾條引物通用的PCR．反應(yīng)體系：(1)50 μ 1反應(yīng)體系：其中10×PCR buffer5.0 μ 1，Dntp(2.5mM)6.0 μ 1，Mg2+(25：Mm)6.0 μ 1，引物(10 u M)各3.0 μ1，模板DNA 6.0 μ 1，Taq酶(5U/μ 1)2.5 μ 1，去離

10、子水17.5μ1。擴增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢用0.5 μ g/ml的EB染色，拍照。(2)擴增程序：94℃預(yù)變性8 min，變性94℃，1 min：復(fù)性45℃(ST479C)或55℃(ST479E)，1 min；延伸72℃，1.5 min；40個循環(huán)，72℃10 min補齊。
　　 本實驗結(jié)果顯示：根據(jù)特異性條帶ST479序列設(shè)計的SCAR引物ST479C對山茉萸及山楂、葡萄和株術(shù)樣本的c

11、pDNA進(jìn)行SCAR．?dāng)U增(圖31)，山茉萸擴增產(chǎn)生單一的譜帶，而山楂、葡萄和株木則產(chǎn)生二至四條譜帶，可以做為鑒別山茱萸的依據(jù)：根據(jù)特異性條帶ST479序列設(shè)計的SCAR引物ST4。79E對7個山茉萸品種及株木、四照花、葡萄、山楂樣本的cpDNA進(jìn)行SCAR擴增(圖32)，發(fā)現(xiàn)7個山茉萸品種均能產(chǎn)生單一的PCR產(chǎn)物，而且譜帶的大小與原始的RAPD標(biāo)記基本一致，由膠圖可見山茱萸和株木、四照花、葡萄、山楂產(chǎn)生的譜帶截然不同，說明可以運用ST