龜板有效成分促間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的miRNA-VDR網(wǎng)絡(luò)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前研究最多、應(yīng)用潛力最大的干細(xì)胞之一，是研究增殖與分化機(jī)理的理想模型。但是，骨髓中BMSCs含量極少，長(zhǎng)期增殖活性弱，擴(kuò)增速度慢，逐漸向脂肪老化，無法滿足大量的臨床需求。眾多的體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)移植研究表明，移植的BMSCs增殖活力不夠，存活量較少，嚴(yán)重限制了BMSCs的應(yīng)用研究。而且BMSCs成骨活性弱，骨化過程較慢，因此，如何提高

2、BMSCs的成骨潛能是近年來研究的熱點(diǎn)。
　　補(bǔ)腎中藥提取物龜板提取物及其有效成分可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨分化。近幾年來本課題組著重探討了補(bǔ)腎龜板對(duì)各類干細(xì)胞的定向分化作用。積累了豐富的前期研究工作基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)龜板提取物促進(jìn)BMSCs向成骨分化可能與其內(nèi)的小分子脂肪酸類、脂肪酸酯類、甾體直接進(jìn)入細(xì)胞膜作用內(nèi)部核受體有關(guān)。龜板提取物可上調(diào)BMSCs定向成骨分化過程中維生素D受體(vitamin D responsive，VDR)的

3、表達(dá)，這在一定的程度上揭示龜板促進(jìn)BMSCs定向成骨分化的可能機(jī)制。因此，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上深入研究探索龜板提取物及其有效成分靶向VDR對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用的分子機(jī)制研究。
　　方法:
　　1.通過lncRNA芯片技術(shù)分析龜板有效成分差異性表達(dá)情況，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)分析差異性表達(dá)的IncRNA共表達(dá)基因，預(yù)測(cè)分析其共表達(dá)的靶基因，運(yùn)用生物學(xué)功能聚類分析的方法了解其參與成骨分化的相關(guān)情況，通過trans

4、和cis預(yù)測(cè)分析差異性lncRNA參與基因的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建TF-IncRNA-靶基因三者的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。
　　2.構(gòu)建了維生素D受體反應(yīng)元件(vitamin D responsive element，VDRE)驅(qū)動(dòng)的熒光素酶(Luc)報(bào)告基因系統(tǒng)，確定了VDR這一核受體靶基因?qū)敯宕俪晒欠只钚猿煞址磻?yīng)元件，尋找出促BMSCs成骨分化的最佳龜板提取物(PTE)組分。
　　3.轉(zhuǎn)染維生素D受體(VDR)與其功能區(qū)截?cái)囿w到骨髓間充質(zhì)

5、干細(xì)胞(BMSCs)中，觀察何種核受體功能區(qū)在龜板有效成分促成骨分化中起作用。
　　4.以龜板提取物及其有效成分干預(yù)BMSCs，正常BMSCs作為對(duì)照組，通過miRNA基因芯片篩查及qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)成骨分化方面有關(guān)的miRNA信息。
　　5.結(jié)合前面miRNA基因芯片和qRT-PCR信息，篩選出miRNA-351，其靶基因?yàn)閂DR mRNA，特引入rno-miR-351 mimic與預(yù)測(cè)靶基因VDR3'UTR雙熒

6、光素酶檢測(cè)，以驗(yàn)證miRNA是否抑制候選靶基因翻譯水平。
　　結(jié)果:
　　1.通過lncRNA基因芯片的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了龜板有效成分差異性表達(dá)的lncRNA和mRNA。
　　2.pathway和GO聚類分析確定了分子之間的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步分析了龜板有效成分差異性表達(dá)的lncRNA與TF及cis調(diào)控的關(guān)系。
　　3.通過trans分析，構(gòu)建了lncRNA-mRNA-轉(zhuǎn)錄因子三元共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　4.時(shí)效表達(dá)

7、初步結(jié)論:各組分均有不同程度的促進(jìn)作用。不同劑量的結(jié)構(gòu)類似物在藥物作用最佳時(shí)間點(diǎn)，有不同程度的促進(jìn)作用，30μg/mL對(duì)VDRE的表達(dá)效率最高。
　　5.4甾酮(S9)是作用于VDR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pCMV-Myc-VDR-C)而促進(jìn)BMSCs成骨分化的。
　　6.經(jīng)過基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過龜板總提取物(2B)、S9干預(yù)后，miRNA-330-3p、miRNA-200a-5p、miRNA-296-3p表達(dá)上

8、調(diào)，同時(shí)miRNA-615、miRNA-351-3p、miRNA-129-1-3p、miRNA-466b-2-3p、miRNA-466b-1-3p表達(dá)下調(diào)。
　　7.篩選出的miRNA-351模擬物可有效抑制VDR的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染miRNA-351抑制劑組則可促進(jìn)VDR蛋白的表達(dá)，miRNA-351與VDR有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，能在其翻譯水平有效抑制VDR的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　祖國(guó)傳統(tǒng)中藥龜板提取物及其有效成分可靶向V