創(chuàng)傷涂膜劑的藥理學研究及安全性評價.pdf

1、目的：創(chuàng)傷涂膜劑是由白求恩國際和平醫(yī)院藥劑科自主研發(fā)的一種具有鎮(zhèn)痛、抑菌和抗感染作用的新型復方涂膜劑，主藥成分包括替硝唑、鹽酸達克羅寧和醋酸氯己定等。本研究的主要目的是對該制劑的藥效學、藥代動力學和安全性進行系統(tǒng)的評價，包括鎮(zhèn)痛試驗、體外抑菌試驗、在體抗感染試驗、藥代動力學研究、皮膚刺激試驗、急性毒性和長期毒性試驗，為報批臨床研究提供數據支持。同時結合該制劑的劑型特點，對其在血液和皮膚組織的藥代動力學特征進行深入細致的研究，為臨床應用選

2、擇合適的用法用量提供科學依據。
　　方法：
　　鎮(zhèn)痛試驗采用豚鼠背部皮膚燙傷和小鼠尾部福爾馬林刺激兩種致痛模型，并與鹽酸達克羅寧膠漿劑進行比較。將80℃水浴中加熱至平衡的砝碼在豚鼠裸露背部皮膚燙5 s制備燙傷模型。豚鼠隨機分為5組，每組6只，分別是空白對照組(基質組)，創(chuàng)傷涂膜劑低、中、高3個劑量組，陽性對照組(鹽酸達克羅寧膠漿)，以20μL/cm2的劑量涂抹藥物或基質，采用針刺法進行痛覺測定，評價指標為平均起效時間、平均持

3、續(xù)時間、有效率。鼠尾福爾馬林試驗分組同豚鼠試驗，每組12只。將小鼠尾部浸入藥液3 min后，皮內注射20％福爾馬林溶液20μL，然后觀察并記錄小鼠舔舐注射部位及尾根部的時間(sec)。
　　體外抑菌試驗采用試管二倍稀釋法，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌四種需氧菌標準菌株，脆弱擬桿菌、產氣莢膜梭菌兩種厭氧菌標準菌株和200種臨床分離菌株進行了體外抑菌效果的評價，分別測定了創(chuàng)傷涂膜劑的最低抑菌濃度(MIC)、

4、最低殺菌濃度(MBC)，同時考察了pH值、細菌接種量、血清蛋白、附加藥物對MIC的影響。
　　在藥代動力學研究中，首先建立同時測定替硝唑、達克羅寧、氯己定濃度的HPLC/MS/MS分析方法，條件如下：色譜柱為Phenomenex GeminiC18(50 mm×2.0 mm，5μm)，流動相為甲醇-10 mmol·L-1甲酸銨(含0.2%甲酸)(56:44，v/v)，流速0.2 mL·min-1，柱溫25℃，通過電噴霧離子化(ES

5、I)三級四極桿串聯(lián)質譜進行正離子多反應選擇監(jiān)測(MRM)。用該法分別測定了大鼠血漿和皮膚微透析樣品的藥物濃度變化情況。實驗前一天，將大鼠背部皮膚用電動剃毛器脫毛，給藥前用砂紙摩擦至滲血制備破損皮膚模型，按20μL/cm2的給藥劑量涂于3 cm×3 cm的創(chuàng)面，測定給藥后0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，14，24 h血漿中的藥物濃度經時變化情況，用DAS2.0.1程序進行數據的模擬分析。利用在體皮膚微透析技術

6、，以5%的葡萄糖溶液(含0.1%甲酸)作為灌流液，使用線性微透析探針，在1.5μL·min-1灌流速度下收集樣品，每20 min收集一次，持續(xù)12 h，透析液樣品直接進行HPLC/MS/MS分析，研究了創(chuàng)傷涂膜劑中各藥物成分在皮膚組織的實時濃度變化情況。
　　皮膚刺激試驗以家兔為模型，分為完整皮膚和破損皮膚組，進行了單次和多次給藥試驗。給藥前將兔的背部脫毛，給藥面積左右各3 cm×3cm。實驗采用同體左右側自身比較，將0.5 mL

7、受試藥物涂布于左側，右側涂布同體積溶劑作為對照。破損皮膚組給藥前使用高壓滅菌砂紙磨擦用藥部位以滲血為度。單次給藥試驗持續(xù)24 h，多次給藥試驗每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。給藥結束后用滅菌水清潔給藥部位除去藥物，分別于除去藥物后1 h、24 h、48 h和72 h，肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況，并進行刺激反應評分。如存在持久性損傷，則延長觀察至14 d，每天觀察一次。對出現(xiàn)中度及以上皮膚刺激性的動物，在觀察期結束時對給藥局部

8、取材，進行組織病理學檢查。
　　毒性試驗包括急性毒性和長期毒性試驗。采用大鼠背部皮膚給藥方法，給藥面積兩側各5 cm×4 cm，給藥量20μL/cm2/次。急性毒性試驗設8個試驗組，每組10只，分別是完整皮膚高劑量涂膜劑組，破損皮膚高、中、低3個劑量的復方涂膜劑組，3個高濃度的單方涂膜劑組和溶劑對照組，共給藥2次，間隔6 h；長毒試驗設9個試驗組，比急毒試驗增加一個完整皮膚空白對照組，每天給藥1次，連續(xù)給藥4周。每次給藥前用溫熱至

9、37℃無菌蒸餾水除去殘留受試物。試驗過程中每天記錄大鼠反應情況，試驗結束后，所有動物被處死，做相應的血液、解剖學和組織病理學檢查。
　　結果：
　　鎮(zhèn)痛試驗：豚鼠背部皮膚燙傷試驗中，各試驗組的有效鎮(zhèn)痛時間范圍為：高劑量組>中劑量組>低劑量組>陽性對照組。成組t檢驗分析顯示，創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組在起效時間、持續(xù)時間和有效率方面均明顯優(yōu)于陽性對照組(P<0.01)，各組鎮(zhèn)痛作用強弱順序依次為：高劑量組>中劑量組>低劑量組>陽性對照

10、組。由鎮(zhèn)痛有效率的卡方分析可知，四個藥物組鎮(zhèn)痛作用的有效率差異顯著；創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組均與陽性對照組的總體有效率差異顯著，且均高于陽性對照組；創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組間的有效率差異顯著。創(chuàng)傷涂膜劑三個劑量組呈現(xiàn)良好的線性關系，r=0.9679。鼠尾福爾馬林試驗中，創(chuàng)傷涂膜劑各劑量組的小鼠舔尾時間與空白對照組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)，與陽性對照組相比也明顯減少。
　　體外抑菌試驗：創(chuàng)傷涂膜劑對所考察的6種標準菌株的MIC

11、和MBC如下：金黃色葡萄球菌0.0625，0.125μg·mL-1；大腸埃希氏菌2，2μg·mL-1；銅綠假單胞菌4，4μg·mL-1；奇異變形桿菌8，8μg·mL-1；脆弱擬桿菌1，1μg·mL-1；產氣莢膜梭菌1，2μg·mL-1。培養(yǎng)基pH5.0和7.0時對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌MIC無影響；pH9.0時金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌MIC降低，脆弱擬桿菌不生長；對產氣莢膜梭菌MIC影響不同。細菌接種量105 CF

12、U·mL-1和107 CFU·mL-1時對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、脆弱擬桿菌、產氣莢膜梭菌MIC均無影響；接種量103 CFU·mL-1時四種標準菌株MIC均有所降低。含25%的胎牛血清營養(yǎng)肉湯，對脆弱擬桿菌MIC無影響，含量為50%、75%時，脆弱擬桿菌MIC均升高；以上三種含量的胎牛血清營養(yǎng)肉湯，對金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌MIC均升高，銅綠假單胞菌均>32μg·mL-1。
　　藥代動力學研究：使用本實驗建立的液質分析

13、方法，空白血漿及空白透析液中內源性物質不干擾待測物的測定，血漿中替硝唑、達克羅寧、氯己定的線性范圍均為2～1000 ng·mL-1，日內RSD均<11.0%，日間RSD均<14.1%，準確度在-7.2～2.9%范圍內，提取回收率均>80%，在室溫放置24 h、-20℃凍存3 d、凍融3次所測得的RE%均在±15%以內。微透析液中三種藥物的線性范圍均為1～200 ng·mL-1，日內RSD均<6.9%，日間RSD均<12.8%，準確度在-

14、5.0～2.7%范圍內，在室溫放置24 h、0～4℃冷藏3d所測得的RE%均在±15%以內。兩種樣品的方法學驗證結果均符合目前生物樣品的測定要求。
　　創(chuàng)傷涂膜劑在大鼠背部破損皮膚，按20μL/cm2劑量給藥后，替硝唑、達克羅寧、氯己定在血漿中的達峰濃度分別為(97.59±47.74)、(20.34±14.20)、(10.00±5，54)ng·mL-1；達峰時間分別為(1.33±0.41)、(1.67±0.26)、(1.42±0.

15、38)h；AUC0-24h分別為(376.25±53.27)、(63.41±27.15)、(69.52±29.02)ng·h·mL-1，血藥濃度數據經DAS軟件模擬，符合二室模型。同時采用微透析技術測得皮膚組織中的藥物達峰濃度分別為(363.24±276.03)、(419.33±184.85)、(15.26±6.51)ng·mL-1；達峰時間分別為(1.17±0.55)、(1.28±0.39)、(1.28±0.39)h；AUC(0-24

16、h)分別為(606.12±225.44)、(871.36±369.31)、(78.45±36.82)ng·h·mL-1。
　　創(chuàng)傷涂膜劑單次和多次給藥皮膚刺激試驗：全部動物(包括完整皮膚組和破損皮膚組)，給藥側與對照側相比，無明顯差異，均未見紅斑、水腫，兩側皮膚刺激評分均為0。
　　急性毒性試驗：完整皮膚給藥后全部動物未見明顯異常表現(xiàn)，創(chuàng)傷涂膜劑的最大無毒性反應劑量(以達克羅寧的含量計算)為0.4 mg/cm2。在破損皮膚給

17、藥的動物中，創(chuàng)傷涂膜劑的最大無毒性反應劑量(NOAEL)為0.2mg/cm2，最小毒性反應劑量(LOAEL)在0.2～0.4mg/cm2范圍內。創(chuàng)傷涂膜劑高劑量組中有8只動物于給藥后8 min～40 min依次出現(xiàn)自發(fā)活動減少、俯臥不動，站立行走不穩(wěn)，側臥不動，上述表現(xiàn)均在給藥后50 min～1 h內恢復。鹽酸達克羅寧組動物給藥后6 min～19 min出現(xiàn)相似的表現(xiàn)，于給藥后50 min～1.5 h恢復。其余各組動物均未見明顯異常表現(xiàn)

18、。給藥后第14 d大體解剖，所有動物肉眼觀察各臟器均未見明顯異常改變。
　　長期毒性試驗：在連續(xù)4周的給藥和2周的恢復期間，未發(fā)生與藥物毒性相關的動物死亡。在第一次給藥后，創(chuàng)傷涂膜劑高、中、低劑量組、各單方組與溶劑對照組比較，動物均出現(xiàn)自發(fā)活動減少，鹽酸達克羅寧組部分動物甚至出現(xiàn)運動失調和強直性抽搐，癥狀持續(xù)時間約1 h。但是出現(xiàn)這些癥狀的時間逐日縮短，至第4周時，各組給藥后均未見異常表現(xiàn)。給藥期間，各給藥組雄性動物體重明顯減輕，

19、但試驗結束后可以恢復，雌性動物鹽酸達克羅寧單方組腎上腺重量及腎上腺/體重系數明顯增加，試驗結束后亦可恢復，這兩種現(xiàn)象考慮與操作應激有關。其余各組一般體征、體重、攝食量、血液學、血液生化及組織病理學檢查均未見明顯異常。
　　結論：
　　豚鼠背部皮膚燙傷和小鼠尾部福爾馬林刺激試驗結果表明，創(chuàng)傷涂膜劑對物理刺激和化學刺激引起的動物皮膚損傷有顯著的鎮(zhèn)痛作用，并呈現(xiàn)良好的線性關系，與達克羅寧膠漿劑相比，涂膜劑的鎮(zhèn)痛效果更好。
　

20、　體外抑菌試驗表明該制劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌效果。
　　建立的同時測定替硝唑、達克羅寧、氯己定濃度的HPLC/MS/MS分析方法，靈敏、準確、穩(wěn)定，能夠滿足大鼠在體皮膚微透析樣品和血漿樣品中三種藥物的測定要求；大鼠破損皮膚給藥后，血液和皮膚組織中藥物的吸收速度相似，但皮膚組織中替硝唑和達克羅寧的濃度均明顯高于血液中的藥物濃度，有利于發(fā)揮局部抗菌和鎮(zhèn)痛作用，氯己定在血液和皮膚組織中的吸收程度均較小。