鈦納米管及其負(fù)載地塞米松的載藥系統(tǒng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及成骨分化的影響.pdf

1、研究背景:鈦是一種骨科或牙科最常用的植入物生物材料。雖然其具有優(yōu)良的機(jī)械和生物學(xué)性能，但長(zhǎng)期觀察表明，該類材料在體內(nèi)的骨整合速度和能力相對(duì)較差[1]。如何改善鈦的生物學(xué)性能，提高鈦與周圍組織的相容性，促進(jìn)和加速骨整合已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。很多學(xué)者認(rèn)為材料表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)是影響細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的一個(gè)最重要因素[2-4]。TiO2納米管由于具有高比表面積和有序的一維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，相對(duì)于光滑面純鈦而言，TiO2納米管更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(M

2、esenchymal stem cells，MSCs)的成骨向分化[5]。但關(guān)于不同管徑TiO2納米管對(duì)細(xì)胞粘附、增殖及分化能力的影響尚存爭(zhēng)議[6-8]。MSCs是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[9-10]，如何高效誘導(dǎo)其成骨向分化一直以來(lái)是骨組織工程研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[11-17]。學(xué)者們普遍認(rèn)為不同的培養(yǎng)基對(duì)MSCs成骨向分化的影響不同[13]，抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松的聯(lián)合使用是體外誘導(dǎo)其成骨向分化的經(jīng)典方法[16]。TiO2

3、納米管可以作為制備太陽(yáng)能電池、制氫器及種植體的材料，還可以作為納米儲(chǔ)存器負(fù)載藥物[18-21]。
　　目的:1.研究不同管徑鈦納米管表面結(jié)構(gòu)對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及成骨向分化的影響;2.在不同培養(yǎng)基中，對(duì)比研究SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在TiO2納米管表面的成骨向分化特點(diǎn);3.構(gòu)建負(fù)載地塞米松的鈦納米管載藥系統(tǒng)，并研究其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及成骨向分化的影響。
　　方法:分離并擴(kuò)增MSCs，成骨、

4、成脂向誘導(dǎo)分化及流式細(xì)胞鑒定;陽(yáng)極氧化法分別制備管徑30、70、100nm的TiO2納米管。1.掃描電鏡觀察管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面形貌、接觸角測(cè)試材料表面親疏水性;MTT法檢測(cè)細(xì)胞在材料表面粘附及增殖情況，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面形貌。評(píng)價(jià)細(xì)胞在純鈦、管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面成骨向分化過(guò)程中堿性磷酸酶活性變化特征及礦化情況。Real-time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)14d后Runx2及OS

5、X基因表達(dá)情況。2.使用4種培養(yǎng)體系:常規(guī)培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+1α，25-雙羥維生素D3培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系，分別在光滑面純鈦片，管徑30、70、100 nm的TiO2納米管表面培養(yǎng)MSCs，3、7、14d后檢測(cè)堿性磷酸酶活性;21d后檢測(cè)鈣沉積量;14d后Real-timePCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因Runx2及OSX的表達(dá)。3.采用滴加法在管徑30、70、1

6、00 nm的TiO2納米管表面負(fù)載地塞米松;利用層層自組裝技術(shù)(layer-by-layer self-assembly technique，LBL)制備明膠/殼聚糖多層膜復(fù)合結(jié)構(gòu);使用掃描電鏡，接觸角測(cè)試及X射線熒光顯微鏡（X-Ray Fluorescence Spectrometer，XRF）檢測(cè)多層膜的構(gòu)建。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其藥物釋放性能。激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在負(fù)載地塞米松的鈦納米管載藥系統(tǒng)表面培養(yǎng)24

7、h的生長(zhǎng)形態(tài)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞在材料表面粘附及增殖情況。檢測(cè)細(xì)胞在純鈦、管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面培養(yǎng)3、7、14d后堿性磷酸酶活性變化特征及培養(yǎng)21d后的礦化情況。Real-time PCR檢測(cè)培養(yǎng)7、14、21d的Runx2及OSX基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:分離獲得的MSCs具有成骨、成脂向分化的能力，CD29陽(yáng)性細(xì)胞為99.65％，CD44陽(yáng)性細(xì)胞為99.81％，CD45陽(yáng)性細(xì)胞為1.42％;掃描電鏡(S

8、EM)觀察各組材料表面管徑均達(dá)到設(shè)計(jì)要求。1.管徑為70nm的TiO2納米管材料表面親水性較好(P＜0.05); MTT結(jié)果示70nm組MSCs的粘附、增殖均較其他組明顯增高(P＜0.05);30nm組在成骨誘導(dǎo)7d后，堿性磷酸酶活性均高于其他組(P＜0.05)。30nm組在成骨誘導(dǎo)21d后表面礦化高于其他組(P＜0.05)。30nm組在成骨誘導(dǎo)14d后Runx2及OSX基因表達(dá)高于其余組(P＜0.05)。2.同一種TiO2納米管結(jié)構(gòu)表

9、面，抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松組堿性磷酸酶活性(F=338.542，P=0.000)、鈣沉積量(F=417.012，P=0.000)及成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2(F=14.419，P=0.000)和OSX(F=42.011，P=0.000)的表達(dá)均較其他組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同一種培養(yǎng)體系下，管徑30nm的TiO2納米管結(jié)構(gòu)表面堿性磷酸酶活性(F=53.170，P=0.000)、鈣沉積量(F=264.268，P=0.000)

10、及成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2(F=3.196，P=0.037)及OSX(F=5.895，P=0.003)的表達(dá)均較其他組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)體系與材料結(jié)構(gòu)有交互作用(堿性磷酸酶活性(F=6.322，P=0.000)、鈣沉積量(F=33.330，P=0.000)、OSX的表達(dá)量(F=2.825，P=0.015))，其中抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系和管徑30 nm的TiO2納米管結(jié)構(gòu)是最佳組合。3.制備的負(fù)載地塞米松的

11、TiO2納米管具備緩釋功能;激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察到MSCs在負(fù)載地塞米松的TiO2納米管表面的粘附及鋪展?fàn)顟B(tài)較好;MTT結(jié)果示負(fù)載地塞米松的TiO2納米管促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附及增殖;負(fù)載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導(dǎo)7d后，堿性磷酸酶活性均高于純鈦組(P＜0.05)。負(fù)載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導(dǎo)21d后表面礦化高于純鈦組(P＜0.05)。負(fù)載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導(dǎo)14d后Runx2及OSX

12、基因表達(dá)高于純鈦組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.與光滑面純鈦相比，不同管徑的TiO2納米管對(duì)MSCs的作用各不相同，MSCs在管徑70nm的TiO2納米管表面增殖能力和粘附性較好，但在管徑30nm的TiO2納米管表面的成骨向分化能力較強(qiáng);2.MSCs的成骨向分化與材料的表面結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)藥物的化學(xué)刺激相關(guān)。在相同的TiO2納米管結(jié)構(gòu)表面，MSCs在抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系下成骨向分化能力較好;在相同培養(yǎng)體系下，管