穿膜肽修飾的納米明膠硅氧烷負載p53對肝癌抑制效果.pdf

1、目的：
　　目前基因治療的最大挑戰(zhàn)仍然是高效、安全的基因載體和治療基因的選擇。明膠硅氧烷納米顆粒(GS NPs)具有低毒性，表面易修飾，易于重復合成等優(yōu)點，由于其表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導目的基因進入細胞并轉染。作為一種非病毒基因載體，其低轉染效率是制約因素。本課題通過將細胞穿膜肽Tat修飾到GS NPs表面從而提高轉染效率。Tat是一段取自人類免疫性缺陷病毒1(HIV-1)蛋白中的48-62位氨基

2、酸序列(KYGRRRQRRKKRGC)的多肽，含有一定的核定位序列，可誘導蛋白質和DNA進入細胞核區(qū)域，并能促進細胞對多種材料的內吞效率。此外，p53作為一種抑癌基因，在正常情況下發(fā)揮監(jiān)測作用，參與細胞對DNA損傷的應答，與細胞周期、凋亡和分化有關。因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs，并通過Tat共價修飾，攜載p53基因對肝癌的抑制效果是本課題的主要研究方向。
　　方法:
　　1）合成納米明膠硅氧烷，以Tat共價連接修飾得

3、到Tat-GS NPs，通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)、透射電鏡(TEM)、動態(tài)光散射粒徑分析(DLS)、表面Zeta電位檢測、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、熱重分析儀(TG)等表征方式對其修飾前后的形貌、粒徑、表面電位、結構組成、有機物含量等進行分析比較。
　　2)凝膠電泳實驗檢測GS NPs和Tat-GS NPs對pEGFP-C1-p53(pDNA)的包封率、釋放性、復合物穩(wěn)定性進行研究，并通過粒徑和電位分析選取進入細胞

4、的較合適的負載量比。
　　3)評價Tat修飾前后納米顆粒的生物相容性;體外轉染熒光觀察評價其作為基因載體的可行性，并進一步探討納米粒子進入細胞情況和逃逸溶酶體情況。
　　4)MTT法檢測GS NPs、Tat-GS NPs攜載p53對肝癌的抑制效果。Hoechst33258凋亡細胞染色和Western blot實驗研究其抑癌機理。
　　結果與結論:
　　1)制備的明膠硅氧烷納米顆粒及Tat修飾后（簡稱Tat-GS）

5、呈不規(guī)則球狀，Tat-GS出現(xiàn)聚集傾向，平均粒徑為289nm相比于250nm的GS，有所增大。GS、Tat-GS的表面電位分別為38mV和35mV。
　　2)Tat修飾后對pDNA的包封率降低，Tat-GS/p53在質量比為100∶1時才能實現(xiàn)完全包裹，而GS/p53在質量比30∶1下就能完全包裹。但Tat的修飾對其釋放性和穩(wěn)定性基本無影響。且通過粒徑、電位分析表明納米粒子和pDNA在質量比為200∶1時合成的復合物粒徑較小，表面

6、呈一定的正電位，有利于細胞的胞吞進入，因此后續(xù)納米復合物均采用200∶1質量比合成。
　　3)毒性實驗表明GS具有良好的生物相容性，且Tat的修飾幾乎對毒性無影響，生物安全性較高，且對pDNA的轉染實驗表明Tat-GS具有較高的轉染效率，其原因是Tat作為一種穿膜肽，具有增強載體復合物進入細胞的能力和逃逸溶酶體的能力。
　　4)Tat-GS-p53對肝癌細胞具有更強的抑制效果，其抑癌作用可能是由介導p53蛋白的表達，引起細胞