納米HAp介導(dǎo)p53與阿霉素對肝癌的協(xié)同抑制效應(yīng).pdf

1、聯(lián)合傳統(tǒng)的化療與新興的基因療法有可能作為一種治愈肝細(xì)胞癌（HCC）的途徑。超過50％的腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變，若在腫瘤細(xì)胞內(nèi)引入并表達(dá)p53基因，可以重啟p53凋亡途徑，對化療藥物如阿霉素（Dox）引起的基因損傷作出應(yīng)答，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。基因和藥物聯(lián)合治療存在的最大障礙是尋求一種安全性共傳遞載體，可加大基因的轉(zhuǎn)染效率，并減少化療藥物對機(jī)體產(chǎn)生的副作用。作為骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分，羥基磷灰石（HAp）以其優(yōu)異的生物相容性和生

2、物降解性備受親睞，但是單純的羥基磷灰石胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下，所以本課題以陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）修飾納米HAp，共傳遞抗腫瘤基因p53和抗腫瘤藥物阿霉素進(jìn)入癌細(xì)胞，并進(jìn)一步探究聯(lián)合治療于體內(nèi)外對肝細(xì)胞癌的協(xié)同抑制效應(yīng)。
　　方法：
　　1）制備一種新型納米HAp，通過場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）、X射線衍射（XRD）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、透射電子顯微鏡（TEM）、選區(qū)電子衍射（SAED）、原子力顯微鏡（AFM）

3、等方法對合成的納米HAp顆粒形貌、粒徑和結(jié)晶度等性質(zhì)進(jìn)行表征，并建立穩(wěn)定的納米HAp合成工藝路線。
　　2）以聚乙烯亞胺對制備的納米HAp進(jìn)行表面修飾，生成納米HAp與聚乙烯亞胺（HAp-PEI，簡稱HP）復(fù)合物，通過細(xì)胞凋亡檢測試劑CCK-8分析并檢測HAp與HP對肝癌細(xì)胞系HuH-7、Hep-3B、SMMC-7721和肝正常細(xì)胞系L-02的毒性。
　　3）以HP負(fù)載重組質(zhì)粒pEGFP-C1-p53轉(zhuǎn)染L-02肝正常細(xì)胞和

4、HuH-7、Hep-3B、SMMC-7721肝癌細(xì)胞，通過熒光倒置顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析載基因顆粒HP-pEGFP-C1-p53（簡寫為HP-p53）于各細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率。
　　4）通過瓊脂糖凝膠電泳、分光光度計(jì)評估HP對p53和Dox的裝載能力；制備HP負(fù)載p53和Dox的混合納米顆粒（HP-p53/Dox）,并通過生理鹽水模擬體內(nèi)環(huán)境分析HP-p53/Dox對p53和Dox的緩釋作用。
　　5）以熒光倒置顯微鏡觀察HP-p

5、53/Dox進(jìn)入肝癌細(xì)胞后，p53和Dox是否可共定位于同一細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮聯(lián)合抗癌作用。
　　6）通過CCK-8分析并檢測HP-p53/Dox在體外對肝癌細(xì)胞的凋亡作用；建立肝癌移植瘤模型，通過腫瘤的增長和小鼠體重的變化分析HP-p53/Dox在體內(nèi)的抑癌效果。
　　7）通過熒光倒置顯微鏡和CCK-8評估HP-p53/Dox對宮頸癌細(xì)胞HeLa和胰腺癌細(xì)胞PANC-1的轉(zhuǎn)染效率及體外抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果：
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6、）制備的納米HAp為棒狀結(jié)構(gòu)，長徑為20-50nm，短徑約為20nm，結(jié)晶度低，具有良好分散性；以PEI修飾HAp后得到HP納米顆粒，對HAp的形貌和分散性沒有影響，并且制備的HAp和HP在所取濃度范圍內(nèi)對肝正常細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的活力幾乎沒有影響。
　　2）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，結(jié)果顯示HP-53對HuH-7具有有良好的轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到10.0％，已非常接近商用轉(zhuǎn)染試劑 TurboFect（10.7％）；對Hep-3B、SMMC-77

7、21的轉(zhuǎn)染效果次之，對L-02幾乎無轉(zhuǎn)染作用。
　　3）HP可高效包封p53和Dox。100μLHP對p53的完全吸附量不小于6μg，對Dox的吸附量在16.85μg左右，而且HP-p53/Dox在體外有良好的基因、藥物緩釋效果。
　　4）HP-p53/Dox經(jīng)胞吞作用進(jìn)入癌細(xì)胞后，p53和Dox可定位于同一細(xì)胞核，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮聯(lián)合抗癌作用。
　　5）相較于單一 p53（細(xì)胞活力約為99％）或 Dox（細(xì)胞活力

8、約為53％）處理，HP-p53/Dox聯(lián)合處理組（細(xì)胞活力約為36％）在體外可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的凋亡；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比（腫瘤增長約為24倍），HP-p53/Dox組（腫瘤增長約為6倍）的小鼠腫瘤在體內(nèi)可顯著抑制腫瘤生長，并維持實(shí)驗(yàn)小鼠體重的穩(wěn)定，增強(qiáng)小鼠的生理機(jī)能。
　　6）HAp和HP在所取濃度范圍內(nèi)對HeLa和PANC-1的細(xì)胞活力無顯著影響，HP-53在兩種癌細(xì)胞內(nèi)有較好的轉(zhuǎn)染作用，并且 HP-p53/Dox可增強(qiáng)