阿霉素對p53缺陷細(xì)胞MDa-MB-231表達(dá)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：阿霉素是臨床上治療乳腺癌常見的化療藥物，而治療過程中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)化療耐藥原因可能與腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力異常增強(qiáng)有關(guān)。阿霉素能導(dǎo)致DNA損傷，但其對腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)及功能的影響尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)主要研究阿霉素對人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白BRCA1、PARP-1和KIF4等蛋白表達(dá)及活性的影響，為進(jìn)一步研究它們在乳腺癌的阿霉素耐藥中作用提

2、供線索。
　　方法：按一定密度接種MDA-MB-231細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，次日，換新鮮含10％胎牛血清的DMEM2 ml，分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞，24h后裂解細(xì)胞，收集蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4-的表達(dá)及PARP-1的活性。
　　接種MDA-MB-231細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，次日，換用新鮮的DMEM，以未

3、處理組作為對照組，用0.5、1、1.5、2、2.5、3μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞1h，用PBS洗細(xì)胞兩遍，然后，換用新鮮的DMEM1 ml繼續(xù)培養(yǎng)，20min后裂解細(xì)胞，收集蛋白，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4的表達(dá)及PARP-1的活性。
　　接種3.5×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，次日，用1μmol·L-1的阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞，未處理組作

4、為對照組，處理24h后用PBS洗細(xì)胞兩遍，再換用新鮮含10％胎牛血清的DMEM1 ml分別培養(yǎng)0、20、40、60min，裂解細(xì)胞，收集蛋白，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4的表達(dá)及PARP-1的活性。
　　按一定密度(3×105)接種MDA-MB-231細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，次日換新鮮含10％胎牛血清的DMEM2 ml，分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1的阿霉素處理MDA-MB-2

5、31細(xì)胞，于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收取細(xì)胞上清液，而細(xì)胞用PBS洗滌兩遍，不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，合并上清液和細(xì)胞，再用PBS洗滌兩次，然后用500μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μl的Annevin V-FITC和5μl的PI，避光反應(yīng)5-15min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及存活數(shù)量。
　　結(jié)果：Western blot檢測不同濃度阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示，0.05、0.1、0.

6、5μmol·L-1濃度阿霉素對PARP-1活性無明顯影響，但1μmol·L-1及以上濃度阿霉素可顯著抑制PARP-1活性；阿霉素對全長PARP-1蛋白水平無明顯影響，但隨著阿霉素濃度的提高，可見少量斷裂的PARP-1蛋白條帶；阿霉素可抑制KIF4表達(dá)，并在1μmol·L-1及以上濃度對KIF4抑制非常明顯；在0.05、0.1、0.5、1μmol·L-1濃度阿霉素作用下BRCA1表達(dá)明顯增加，在2μmol·L-1濃度阿霉素作用下BRCA1

7、蛋白水平雖然仍高于對照組，但低于0.05、0.1、0.5、1μmol·L-1濃度阿霉素作用組。
　　阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞1 h，恢復(fù)20 min后Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白，結(jié)果表明，PARP-1活性在0.5、1、1.5、2μmo1·L-1濃度阿霉素作用下呈增強(qiáng)趨勢，但當(dāng)阿霉素濃度升高到2.5、3μmol·L-1又被抑制；阿霉素短時(shí)間(1h)的作用對PARP-1和KIF4表達(dá)無明顯影響，PARP-1也不發(fā)

8、生斷裂，而阿霉素作用后BRCA1的表達(dá)略有增加。
　　1μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，恢復(fù)不同時(shí)間后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在阿霉素處理后PARP-1活性被抑制，但給予恢復(fù)時(shí)間，其活性將逐漸增加；恢復(fù)時(shí)間對PARP-1全長蛋白水平表達(dá)無明顯影響，恢復(fù)時(shí)間延長，PARP-1蛋白的斷裂有所減少；阿霉素處理給予恢復(fù)時(shí)間，BRCA1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在處理恢復(fù)時(shí)間0、20和40mi

9、n后，BRCA1表達(dá)增強(qiáng)，而在恢復(fù)60min后BRCA1表達(dá)雖有所減少，但仍高于對照組；阿霉素處理后MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)KIF4減少，恢復(fù)時(shí)間越長降低越明顯。
　　不同濃度阿霉素處理MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測，低濃度阿霉素可引起腫瘤細(xì)胞凋亡，隨著阿霉素濃度的提高，細(xì)胞由凋亡逐漸進(jìn)入死亡，死亡率逐步增加，存活率下降，在1μmol·L-1濃度阿霉素時(shí)，細(xì)胞凋亡率為9.01％，而細(xì)胞存活率減至35.36％，