鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT25是小鼠精子發(fā)生和雄性生育所必需的.pdf

1、目的:
　　研究鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?5(Ift25)對(duì)小鼠精子鞭毛的形成的影響以及對(duì)雄性生育的作用。
　　方法:
　　1.Ift25flox/flox的雌性小鼠與Stra8-iCre雄鼠雜交得到stra8-iCre;Ift25flox/-;
　　2.RT-PCR檢測(cè)IFT25基因在小鼠不同組織中mRNA的表達(dá);
　　3.Western Blot檢測(cè)不同蛋白在小鼠不同組織及敲除小鼠與對(duì)照小鼠中的蛋白表達(dá)情況;

2、r>　　4.HE染色檢測(cè)Ift25基因敲除小鼠附睪及睪丸中精子發(fā)生不同階段的形態(tài)變化;
　　5.生精細(xì)胞切片制備:生精細(xì)胞切片染色觀察精子鞭毛附屬結(jié)構(gòu);
　　6.SEM觀察精子的超微結(jié)構(gòu)變化及TEM觀察附睪及睪丸的超微結(jié)構(gòu)變化;
　　7.酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)蛋白之間的相互作用;
　　8.統(tǒng)計(jì)分析精子計(jì)數(shù)、精子運(yùn)動(dòng)速率、活精子比率等統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　在雄性小鼠中，Ift25基因

3、在睪丸組織中高度表達(dá)，并且在精子發(fā)生的第三階段（精子鞭毛形成階段）表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。為了探索Ift25在精子鞭毛形成中的作用，本研究在雄性生殖細(xì)胞中特異性敲除這個(gè)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，所有Ift25基因敲除小鼠都能夠活到成年，并沒有任何生長(zhǎng)異常。然而，生育能力測(cè)試表明所有的基因敲除小鼠表現(xiàn)出完全不育。統(tǒng)計(jì)分析表明在ft25基因基因敲除小鼠中精子數(shù)量明顯下降，且完全喪失運(yùn)動(dòng)能力。HE染色發(fā)現(xiàn)Ift25基因敲除小鼠曲精小管管腔中生

4、精細(xì)胞數(shù)量明顯下降，排列紊亂，成熟階段的精子很少。光鏡下觀察到多種異常的精子形態(tài)，如圓形的頭部，短而彎曲或末端腫脹的尾巴，分枝的鞭毛及異常增厚的鞭毛。透射電鏡下觀察到的精子異常表型與光鏡下的形態(tài)變化一致。掃描電鏡顯示Ift25基因敲除的小鼠絕大多數(shù)發(fā)育成熟的精子失去“9+2”結(jié)構(gòu)及附屬結(jié)構(gòu)，包括外層致密纖維，纖維鞘和線粒體鞘也被破壞。在Ift25基因敲除的小鼠附睪精子中，纖維鞘的主要組成成分AKAP4不表達(dá);而外層致密纖維的組成成分之一

5、ODF2仍然存在，但其定位的附屬結(jié)構(gòu)包括外層致密纖維和纖維鞘也被破壞。在Ift25基因敲除小鼠中，Ift27，是Ift25的一個(gè)相互作用蛋白，也完全消失。而且我們檢測(cè)的其他Ift蛋白中，Ift20和Ift81在Ift25基因基因敲除小鼠中表達(dá)量明顯下降，而ft74和Ift140的表達(dá)量卻沒有明顯變化。
　　結(jié)論:
　　鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?5（Ift25）是小鼠精子鞭毛形成和雄性生育所必需的蛋白，在調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程中起著重要的作用