歐洲葡萄VvDRL1基因的功能研究.pdf

1、NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。其共同特點(diǎn)是在N端含有一段高度保守、由約150個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，而C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的開花誘導(dǎo)，胚胎發(fā)育，次生壁加厚，細(xì)胞分裂等方面發(fā)揮著重要作用。本研究以歐洲葡萄“粉紅亞都蜜”（Yatomi Rosa）為材料，采用同源克隆法進(jìn)行NAC轉(zhuǎn)錄因子VvDRL1基因及其啟動(dòng)子（PVvDRL1）基因的克隆，通過構(gòu)建pWR306-VvDRL1過量表達(dá)載體以及

2、pCAMBIA1391Z-PVvDRL1表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化本氏煙草，獲得穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因植株，以驗(yàn)證VvDRL1基因的功能。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用石蠟切片進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，轉(zhuǎn)基因植株主葉脈上表皮下面缺失2-3層厚壁細(xì)胞，且轉(zhuǎn)基因植株海綿組織內(nèi)的空隙明顯多于野生型植株。研究結(jié)果表明，VvDRL1基因在調(diào)控植株的形態(tài)發(fā)育方面起著重要作用。⑵通過花粉離體萌發(fā)法、I2-KI法和FDA染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株花粉

3、的活性和育性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)離體萌發(fā)4-6 h時(shí)WT植株的花粉萌發(fā)率為86.84%，而轉(zhuǎn)基因植株的花粉萌發(fā)率僅為14.08%；用1%I2-KI溶液染色發(fā)現(xiàn)WT植株花粉被染成深藍(lán)色的占84.72%，而轉(zhuǎn)基因植株只有21.95%被染成藍(lán)色，且顏色較淺；通過用 FDA染色，在熒光顯微鏡藍(lán)光下觀察，發(fā)現(xiàn)WT植株花粉熒光較強(qiáng)的占92.45%，而轉(zhuǎn)基因植株只有25.00%。將 PVvDRL1轉(zhuǎn)基因煙草不同發(fā)育時(shí)期的花進(jìn)行 GUS染色，發(fā)現(xiàn)該基因在柱頭中的

4、染色最深，其次是花粉，隨著發(fā)育時(shí)期的延長染色逐漸加深。研究結(jié)果表明，VvDRL1基因在調(diào)控花發(fā)育方面起著重要作用。⑶對(duì)幼葉、成熟葉、老葉和黃葉進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)VvDRL1基因在不同發(fā)育時(shí)期的葉片中表達(dá)量不同，依次為幼葉＞成熟葉＞老葉＞黃葉；分別測(cè)定苗齡為8周的WT和轉(zhuǎn)基因植株葉片的鮮重、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒夂碗x子滲透率，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量和葉綠素?zé)晒怙@著高于WT，離子滲透率顯著低于WT；將PVvDRL1轉(zhuǎn)基因煙草

5、植株進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)越嫩的葉片染色越深，越老的葉片染色越淺。研究結(jié)果表明，VvDRL1基因與調(diào)控植株衰老方面發(fā)揮著重要的作用。⑷用3種促進(jìn)生長的激素（IAA、6-BA、GA3）和4種促進(jìn)衰老的激素（ETH、MeJA、SA、ABA）處理葡萄成熟葉片，采用qRT-PCR技術(shù)分析VvDRL1基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7種激素隨著處理時(shí)間的延長表達(dá)量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這說明VvDRL1基因可能通過ETH、MeJA、SA、ABA這四種激素調(diào)控植株