葡萄VvUGT72B1基因和楊樹PtUGT72B1基因的合成與功能鑒定.pdf

1、一些酚類化合物(PhenolicCompounds，PCs)及3，4-二氯苯胺(Dichloroaniline，DCA)對(duì)生物體具有致癌性、致畸性和致突變性。這些物質(zhì)中許多是農(nóng)藥、防腐劑、消毒劑和偶氮染料等合成和代謝的中間體。由于這些物質(zhì)的廣泛使用，對(duì)水資源和土壤造成了污染。它們通過土壤和水體等進(jìn)入生物鏈，并最終危害著人類的健康。
　　糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases，GTs，EC2.4.x.y)是一類催化糖基

2、化反應(yīng)的酶，能夠?qū)⑻腔鶑墓w分子轉(zhuǎn)移到特定的受體分子上，從而形成糖苷物。尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶(UridineDiphosphate-glycosyltransferases，UGTs)是GTs1家族的成員。在植物體內(nèi)這類酶催化糖基化反應(yīng)時(shí)，以UDP-糖為糖基供體將糖基轉(zhuǎn)移到植物激素、次生代謝物、病原菌侵染物以及異源毒素等一系列小分子化合物受體上，從而改變其生物活性、水溶性和穩(wěn)定性等特性。一些PCs及3，4-DCA因其苯環(huán)上帶有羥基或氨

3、基，能夠被植物體內(nèi)許多種糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化形成糖苷物而毒性降低。
　　葡萄(Vitisspp.)是世界第二大果樹，自古以來深受人們的喜愛。一些農(nóng)藥的使用和污染水源的灌溉等使得一些有害的PCs和3，4-DCA進(jìn)入葡萄植株。而這些物質(zhì)在進(jìn)入葡萄植株后，如何被轉(zhuǎn)化以及是否會(huì)通過果實(shí)進(jìn)入人體都鮮為人知。楊樹(Populusspp.)因其生長(zhǎng)快、成熟后個(gè)體大、對(duì)有毒物質(zhì)抗性強(qiáng)、能降解許多污染物，同時(shí)也能帶來一定的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，是上佳的研究植物修復(fù)

4、的木本植物。
　　葡萄和楊樹的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，這為基因功能的研究帶來了便利。本文根據(jù)擬南芥中對(duì)2，4，5-三-氯苯酚(Trichlorophenol，TCP)和3，4-DCA糖基化能力最強(qiáng)的AtUGT72B1氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到葡萄和楊樹中與之同源性最高的蛋白各一個(gè)(GenBankAccessionNo:XP_002280923，XP_002320190)。將這兩個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的基因分別命名為VvUGT72B1

5、基因和PtUGT72B1基因。通過修飾，并按照PTDS方法合成這兩個(gè)基因。將這兩個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母中高量表達(dá)，通過篩選和鑒定得到了能夠分別高量表達(dá)這兩種蛋白的陽性菌株。將獲得的畢赤酵母陽性菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取酵母中的蛋白從而獲得重組酶。通過試驗(yàn)驗(yàn)證了VvUGT72B1能夠?qū)?，4，5-TCP、2，6-二甲基苯酚(Dimethylphenol，DMP)、苯酚、對(duì)苯二酚、鄰苯二酚、3-甲基鄰苯二酚(Methylcatechol，MC)

6、和3，4-DCA糖基化，并提高了酵母對(duì)其抗性;PtUGT72B1能夠?qū)⒈椒印⑧彵蕉雍蛯?duì)苯二酚糖基化，并提高了酵母對(duì)其抗性。2，4，5-TCP、苯酚、對(duì)苯二酚和鄰苯二酚被糖基化后的產(chǎn)物分別是2，4，5-TCP-O-葡萄糖苷、苯基葡萄糖苷(Pheny1β-D-glucopyranoside，PGPS)、熊果苷和鄰羥基苯基葡萄糖苷。同時(shí)還檢測(cè)了這兩種酶對(duì)各自底物的活性。通過測(cè)定米氏常數(shù)表明PtUGT72B1對(duì)鄰苯二酚、苯酚和對(duì)苯二酚的親和力

7、依次遞減。
　　將VvUGT72B1基因和PtUGT72B1基因分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥進(jìn)行研究，以便能在將來把這兩個(gè)基因能真正應(yīng)用到植物修復(fù)當(dāng)中。通過農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)過篩選和檢測(cè)獲得能夠分別表達(dá)這兩個(gè)基因的陽性株系。除了苯酚以外，表達(dá)葡萄VvUGT72B1的擬南芥對(duì)其余五種所測(cè)酚類化合物和3，4-DCA的抗性比野生型擬南芥高。表達(dá)楊樹PtUGT72B1的擬南芥株系對(duì)鄰苯二酚和對(duì)苯二酚的抗性比野生型擬南芥提高。而表達(dá)VvU

8、GT72B1和PtUGT72B1的擬南芥株系對(duì)苯酚的抗性比野生型擬南芥明顯降低。降解試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)各自所測(cè)底物的降解能力比野生型擬南芥明顯提高，體內(nèi)生成的糖苷物含量也比野生型擬南芥高。同時(shí)，檢測(cè)到從表達(dá)VvUGT72B1或PtUGT72B1擬南芥中提取的粗酶對(duì)各自所測(cè)底物的糖基化能力比野生型擬南芥都要高。表明2，4，5-TCP、2，6-DMP、對(duì)苯二酚、鄰苯二酚、3-MC和3，4-DCA在擬南芥體內(nèi)被糖基化后對(duì)擬南芥的

9、毒性降低，而苯酚在擬南芥體內(nèi)被糖基化后形成的PGPS對(duì)擬南芥的毒性增高。然而，由于擬南芥對(duì)PGPS的吸收能力遠(yuǎn)不及苯酚，使得野生型擬南芥在含PGPS的培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)比在含有相同摩爾濃度的苯酚的培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)好。此外，擬南芥對(duì)熊果苷的吸收能力也遠(yuǎn)不及對(duì)苯二酚，使得野生型擬南芥在含熊果苷的培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)比在含有相同摩爾濃度的對(duì)苯二酚的培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)好。
　　在本研究中，新發(fā)現(xiàn)了擬南芥能夠?qū)Ⅲw內(nèi)生成的苯酚、2，6-DMP和3-MC的糖苷