擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT72B1調(diào)節(jié)細(xì)胞壁木質(zhì)化的功能研究.pdf

1、細(xì)胞的木質(zhì)化主要是木質(zhì)素在細(xì)胞壁內(nèi)沉淀的過程。正常情況下，該過程主要發(fā)生于維管束的次生木質(zhì)部，進(jìn)而增加木質(zhì)部細(xì)胞壁硬度和機(jī)械支撐力。木質(zhì)素的累積還能增強(qiáng)植物體長距離水分運輸能力以及抵御機(jī)械損傷和病原菌微生物的侵害等。細(xì)胞木質(zhì)化的生理學(xué)過程既是一個代謝問題，又是一個發(fā)育問題。由于調(diào)節(jié)細(xì)胞木質(zhì)化的基因數(shù)量眾多，機(jī)制復(fù)雜，目前了解很少。因此，深入研究細(xì)胞木質(zhì)化的調(diào)控機(jī)理，不僅對于理解植物生長發(fā)育的規(guī)律有重要的科學(xué)理論意義，而且對于農(nóng)作物改良以

2、及樹木材質(zhì)改良具有潛在的應(yīng)用價值。
　　植物體內(nèi)普遍存在木質(zhì)素單體的糖基化修飾現(xiàn)象，然而該現(xiàn)象從上個世紀(jì)六七十年代發(fā)現(xiàn)以來，一直沒有研究清楚木質(zhì)素單體糖基化是否與木質(zhì)素合成之間存在關(guān)系。為了深入理解它們之間的關(guān)系以及探索糖基化修飾在木質(zhì)素代謝以及細(xì)胞木質(zhì)化過程中的作用機(jī)制，我們圍繞糖基轉(zhuǎn)移酶UGT72B1開展了一系列的研究工作，取得了重要進(jìn)展。
　　1.ugt72b1突變體鑒定與表型分析
　　本研究首先篩選鑒定出了UG

3、T72B1兩個擬南芥T-DNA插入突變體ugt72b1ko-1（SALK_049597）和ugt72b1ko-2（SAIL_611_E04）的純合株系，發(fā)現(xiàn)它們有相同的表型:一方面莖尖有大量花青素積累，另一方面莖尖生長受到嚴(yán)重抑制。將UGT72B1基因?qū)氲酵蛔凅w后表型能完全恢復(fù)到野生型狀態(tài)，說明突變體表型確實是由UGT72B1功能缺失導(dǎo)致。我們對莖段橫切面進(jìn)行木質(zhì)素特異性染色，不論是Wiesner染色還是M(a)ule染色，結(jié)果都表明

4、突變體出現(xiàn)了嚴(yán)重的異位木質(zhì)化和細(xì)胞壁木質(zhì)化的增強(qiáng)。木質(zhì)素含量分析表明突變體的木質(zhì)素含量比野生型顯著增加。透射電鏡觀察細(xì)胞壁厚度發(fā)現(xiàn)突變體細(xì)胞壁厚度明顯增厚。以上結(jié)果表明UGT72B1參與了細(xì)胞壁的木質(zhì)化過程，它的功能缺失會導(dǎo)致細(xì)胞壁異位木質(zhì)化和增強(qiáng)的木質(zhì)化，并影響植物的生長發(fā)育。
　　2.UGT72B1底物篩選及生化分析鑒定
　　構(gòu)建了UGT72B1的原核表達(dá)載體，經(jīng)表達(dá)和純化獲得了重組蛋白，利用體外酶促反應(yīng)并借助HPLC-

5、MS技術(shù)，我們對激素類物質(zhì)如生長素和赤霉素等以及苯丙烷類物質(zhì)如木質(zhì)素前體和黃酮類物質(zhì)等進(jìn)行了篩選，鑒定出這個糖基轉(zhuǎn)移酶能夠糖基化松柏醇、二氫松柏醇、對羥基肉桂醇和松柏醛等木質(zhì)素前體。同時我們檢測UGT72B1高表達(dá)體內(nèi)松柏苷含量，發(fā)現(xiàn)明顯高于野生型和恢復(fù)系。對UGT72B1酶促動力學(xué)常數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)UGT72B1對松柏醇的活性最高，比酶活為6.6 nkat/mg，Kcat/Km為0.74 mM1s-1，高于對松柏醛的催化效率（3.1 nk

6、at/mg和0.30 mM-1s-1）。同時我們也對UGT72B1的同源基因UGT72B2和UGT72B3進(jìn)行了原核表達(dá)的蛋白純化和底物篩選，發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠糖基化芥子醛和松柏醛，但沒有發(fā)現(xiàn)UGT72B2對木質(zhì)素前體的酶活性。將UGT72B2和UGT72B3在ugt72b1突變體內(nèi)組成型過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠恢復(fù)ugt72b1的表型，而UGT72B2不能恢復(fù)。以上結(jié)果表明UGT72B1能夠糖基化木質(zhì)素前體。同時也表明UGT

7、72B1與UGT72B3在生化活性上有一定的相似性。
　　3.基因的表達(dá)模式分析
　　構(gòu)建了UGT72B1啟動子驅(qū)動的GUS基因表達(dá)系統(tǒng)，對GUS活性的組織化學(xué)染色表明:幼苗期，UGT72B1在莖生長點及新生葉葉脈的連接處有較強(qiáng)表達(dá);抽薹以后，主要在幼嫩莖尖、幼嫩莖生葉的葉脈、花序柄以及花瓣的維管組織中表達(dá)。從莖的橫切面染色來看，UGT72B1在幼嫩莖的各個組織都有表達(dá)，如木質(zhì)部、髓部和表皮，但是在稍微老點的莖中只在木質(zhì)部表

8、達(dá)。另外通過qRT-PCR也對表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示UGT72B1在各個組織的表達(dá)模式與GUS組織化學(xué)染色結(jié)果基本一致，其中主要在幼嫩的莖中表達(dá)。同時利用GUS染色和qRT-PCR技術(shù)分析了UGT72B2、UGT72B3與UGT72E2基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)UGT72B2主要在葉片的葉脈上表達(dá);UGT72B3主要在葉柄的基部有較強(qiáng)表達(dá)，在幼嫩葉片葉邊緣的出水孔處有很強(qiáng)的表達(dá)，導(dǎo)管處也有微量表達(dá)。UGT72E2主要在苗期表達(dá)，在根和莖

9、中只有少量表達(dá)。檢測了ugt72b1突變體背景下UGT72B3與UGT72E2的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)量都有所提高。以上結(jié)果表明UGT72B1表達(dá)部位正好與突變體產(chǎn)生表型的部位向吻合。幾個進(jìn)化關(guān)系很近的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)模式各不相同，都有自己的表達(dá)部位偏好性，可能與它們發(fā)揮的主要作用相關(guān)。
　　4.突變體轉(zhuǎn)錄組及qRT-PCR分析
　　qRT-PCR檢測木質(zhì)素合成相關(guān)基因（包括前體合成、前體運輸、前體聚合和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）在突

10、變體中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素前體合成相關(guān)基因CCR、COMT、HCT、CAD、4CL、C4H、CCOATOT和PAL都有明顯的上調(diào)表達(dá);前體運輸及聚合相關(guān)基因ABCG、RBOH、PRX和LAC上調(diào)表達(dá)也比較明顯;木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因MYB58、MYB61、MYB63和MYB643以及NAC家族成員NST1和NST3表達(dá)量也顯著上調(diào)。另外我們還檢測到花青素合成通路中的DFR及黃酮合成通路中的CHS上調(diào)表達(dá)比較顯著。這些結(jié)果說明在突變

11、體中涉及木質(zhì)素單體以及木質(zhì)素合成的整個代謝都獲得了增強(qiáng)。為了更加全面了解轉(zhuǎn)錄組的變化，對突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中共有931個基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，其中有705個上調(diào)顯著，226個下調(diào)顯著。差異表達(dá)的基因主要集中在苯丙烷代謝途徑、黃酮合成途徑、植物病原體互作途徑、淀粉和糖代謝途徑、以及苯丙氨酸代謝途徑。但是只有苯丙烷-木質(zhì)素代謝途徑中幾乎每一步的基因都顯示上調(diào)表達(dá)，這與qRT-PCR分析的結(jié)果是一致的。以上結(jié)果表明突變

12、體中UGT72B1的功能缺失激活了苯丙烷-木質(zhì)素合成途徑上的相關(guān)基因，甚至苯丙烷代謝分支途徑里的基因也被激活，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞壁嚴(yán)重的異位木質(zhì)化和木質(zhì)化程度的增強(qiáng)，并且伴有花青素積累和莖生長發(fā)育受阻。
　　總之，本論文的結(jié)果不僅增加了對植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族的功能理解，而且首次證明木質(zhì)素單體的糖基化修飾參與調(diào)節(jié)細(xì)胞壁木質(zhì)素的合成過程，回答了近半個世紀(jì)以來懸而未決的科學(xué)問題，為研究糖基化修飾在木質(zhì)素代謝以及細(xì)胞木質(zhì)化過程中的作用機(jī)制提供了重