葡萄糖調(diào)控新基因GMRP-1與NCEx的表達(dá)及初步功能研究.pdf

1、第一部分 人糖代謝相關(guān)蛋白一1的蛋白表達(dá)與功能的初步研究 目的:克隆和表達(dá)人糖代謝相關(guān)蛋白-1(GMRP-1)基因，初步揭示GMRP-1的功能。方法:RT-PCR克隆GMRP-1基因全長(zhǎng)，將GMRP．1基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a與真核表達(dá)載體pEGFP-C3，在EcolROSSET(DE3)菌中高效表達(dá)并純化GMRP-1融合蛋白，免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體；利用共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在HEK293細(xì)胞中

2、的定位。利用NorthernBlot與WesternBlot技術(shù)觀察了GMRP-1基因和蛋白表達(dá)譜，利用雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在胰腺中的定位。同時(shí)利用NorthernBlot與WesternBlot技術(shù)觀察不同濃度葡萄糖不同作用時(shí)間對(duì)β-TC3細(xì)胞GMRP．1的基因和蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)觀察GMRP-1與β-TC3細(xì)胞胰島素分泌的關(guān)系。結(jié)果:成功制備特異性好、效價(jià)較高的多克隆抗體。激光

3、共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位于HEK293細(xì)胞的細(xì)胞漿中。GMRP-1表達(dá)廣泛，其中在腦、骨骼肌、脂肪、肝臟、主動(dòng)脈、十二指腸及β細(xì)胞株β-TC3中表達(dá)較高。雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡顯示GMRP一1定位在胰島中，在胰腺的外分泌腺中沒(méi)有表達(dá)，同時(shí)GMRP一1與胰島素有部分的重疊。葡萄糖對(duì)β-TC3細(xì)胞GMRP-1表達(dá)的影響呈劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系，葡萄糖濃度增加，GMRP-1表達(dá)增加，20mmol／L濃度下表達(dá)最高。葡萄糖

4、作用時(shí)間增加，GMRP．1表達(dá)增加，72小時(shí)表達(dá)最高。B-TC3細(xì)胞過(guò)表達(dá)GMRP．1及RNA干擾技術(shù)沉默B-TC3細(xì)胞GMRP-1表達(dá)后，胰島素分泌沒(méi)有明顯的差異。結(jié)論:GMRP-1特異性定位于大鼠胰島中，葡萄糖可以調(diào)控它在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)，它在高糖導(dǎo)致的胰島B細(xì)胞功能變化中發(fā)揮重要的作用，它與β細(xì)胞胰島素分泌之間沒(méi)有直接的關(guān)系。 第二部分 人新型鈉鈣交換蛋白NCEx的蛋白表達(dá)與功能的初步研究 目的:克隆

5、和表達(dá)人新型鈉鈣交換蛋白NCEx基因，初步揭示NCEx與糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系。方法:RT-PCR克隆NCEX基因全長(zhǎng)；將NCEX基因構(gòu)建到綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP-C3，利用共聚焦顯微鏡觀察NCEX在HEK293細(xì)胞與小鼠胰島素瘤β-TC3細(xì)胞中的定位。熒光分光光度儀觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。Western印跡檢測(cè)NCEx在高血糖猴各組織與2型糖尿病主動(dòng)脈組織NCEX蛋白的差異表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)NCEX基因在人主動(dòng)脈平滑肌

6、細(xì)胞(HASMC)、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人血管巨噬細(xì)胞(THP-1)細(xì)胞中的表達(dá)及不同葡萄糖濃度對(duì)其基因表達(dá)的影響，Northernblotting雜交驗(yàn)證高糖作用HAEC細(xì)胞NCEXmRNA的表達(dá)差異。結(jié)果:重組載體pGFP-C3一NCEX轉(zhuǎn)染后，定位于HEK293細(xì)胞與B．TC3細(xì)胞的細(xì)胞膜上。熒光分光光度儀觀察到NCEx過(guò)表達(dá)后HEK293細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對(duì)照組，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)細(xì)胞外145mmo

7、l／L的Na+完全由145mmol／L的Li+置換后，NCEx過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度出現(xiàn)大幅度的升高，在測(cè)定過(guò)程中加入終濃度為5mmol／LKCl時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化沒(méi)有影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NCEx蛋白在高血糖猴與糖尿病患者主動(dòng)脈中表達(dá)上調(diào)，而在其他組織中無(wú)差異表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NCEx主要表達(dá)在HAEC中，而HASMC和THP一1表達(dá)量低，RT—PCR和NorthernBlotting結(jié)果顯示NCEx基因在血管內(nèi)皮細(xì)