葡萄糖轉(zhuǎn)化異丁醇代謝途徑的設(shè)計(jì)與表達(dá).pdf

1、能源問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)峻,使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注生物質(zhì)能源的研究。與傳統(tǒng)生物質(zhì)能源——乙醇相比,高碳醇,特別是支鏈高碳醇,具有較小的揮發(fā)性和腐蝕性,較高的辛烷值和能量密度。2008年,James C Liao課題組在大腸桿菌中利用非發(fā)酵途徑方法合成了異丁醇,經(jīng)對(duì)異丁醇代謝途徑及發(fā)酵工藝不斷優(yōu)化后,得率達(dá)到了理論值的86％。然而,發(fā)酵結(jié)束后仍有一部分的葡萄糖沒(méi)有被利用,表明高濃度的異丁醇產(chǎn)物抑制了大腸桿菌的代謝。研究表明,枯草芽孢桿菌對(duì)異丁

2、醇的耐受性高于大腸桿菌,并且自身具有異丁醇合成途徑的優(yōu)勢(shì)基因,因此,本研究選擇在枯草芽孢桿菌中利用合成生物學(xué)的思想構(gòu)建異丁醇的代謝通路,以纈氨酸生物合成途徑中的α-酮異戊酸鹽為前體物,展開(kāi)合成異丁醇的相關(guān)研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pHP13為基礎(chǔ),連接了枯草芽孢桿菌中的強(qiáng)啟動(dòng)子p43,構(gòu)建了表達(dá)載體pP。從乳酸乳球菌基因組DNA上克隆下脫羧酶編碼基因kivd,從釀酒酵母基因組DNA上克隆下脫氫酶基因A

3、DH2,依次連接在表達(dá)載體pP上,由p43啟動(dòng)子啟動(dòng)兩個(gè)基因的表達(dá),構(gòu)建了重組載體pPKA。采用Spizizen轉(zhuǎn)化法將重組載體pPKA轉(zhuǎn)入B.subtilis168中,獲得了重組菌B.subtilis168／pPKA。經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用鑒定,重組菌的發(fā)酵液中有異丁醇存在,說(shuō)明兩個(gè)外源基因在重組菌中成功表達(dá),催化α-酮異戊酸鹽生成了異丁醇。
　　 在成功獲得異丁醇生產(chǎn)菌株B.subtilis168／pPKA后,對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)