基于SCR技術(shù)的多層rFN-CDH融合蛋白界面促成骨效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、自體骨是植骨材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而取骨會造成嚴(yán)重的并發(fā)癥，臨床需要大量高活性骨替代材料。成骨性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性是影響骨愈合的核心因素。羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、多聚乳酸等合成材料及脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）等天然生物材料缺乏成骨前體細(xì)胞和成骨誘導(dǎo)因子，成骨活性十分有限。經(jīng)典的組織工程骨(tissue engineered bone，TEB)成骨能力良好，但制備過程復(fù)雜，難以實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

2、骨髓中含有豐富的成骨相關(guān)細(xì)胞和因子，既往研究表明骨髓局部注射或與支架材料復(fù)合可促進骨愈合。通過選擇性細(xì)胞滯留(selective cell retention，SCR)技術(shù)，可以有效地將骨髓中成骨成分富集于疏松多孔材料，從而實現(xiàn)高活性組織工程骨術(shù)中構(gòu)建。
　　由于制備過程中細(xì)胞外基質(zhì)大量丟失，通常用于SCR技術(shù)的DBM支架材料骨髓富集效率相對有限，通過表面修飾增強支架材料粘附性是提高富集效率和特異性的有效手段。在前期研究中，課題組

3、采用多聚賴氨酸、RADA-16I水凝膠等修飾DBM支架材料，修飾后材料孔徑縮小，對細(xì)胞物理攔截作用增強，材料骨髓富集效率和成骨能力均顯著提高。然而多聚賴氨酸、RADA-16I水凝膠缺乏粘附識別信號，富集細(xì)胞特異性差，富集后缺乏促進成骨的生物刺激。隨著成骨誘導(dǎo)微環(huán)境研究不斷深入，模擬細(xì)胞外基質(zhì)和周圍細(xì)胞作用的支架仿生修飾成為骨組織工程領(lǐng)域近年來研究熱點。為避免天然蛋白成本高、免疫原性、易酶解和短肽特異性差的缺點，多采用高分子多肽或模擬肽。

4、課題組前期通過整合纖維連接蛋白（fibronectin）Ⅲ7-10結(jié)構(gòu)域和鈣粘蛋白(Cadherin11)胞外片段第1、2結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的異源雙分子嵌合式融合蛋白rFN/CDH，該蛋白具有良好的促粘附、促增殖、促成骨效應(yīng)。本研究擬通過層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多層rFN/CDH融合蛋白復(fù)合物修飾DBM支架材料，改善材料表面性質(zhì)，從而提高SCR過程中成骨相關(guān)成分的富集效率，并在植入體內(nèi)后持續(xù)發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用。
　　目的：通過層層自組裝技術(shù)構(gòu)建基

5、于SCR技術(shù)的多層rFN/CDH融合蛋白界面修飾DBM支架材料，增強成骨相關(guān)細(xì)胞和因子在SCR多孔載體的表面和內(nèi)部富集效應(yīng)，探討SCR過程中成骨相關(guān)成分富集和富集后復(fù)合物促進成骨的潛在機制，為進一步研究與開發(fā)術(shù)中即刻構(gòu)建新型組織工程骨修復(fù)材料提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　方法：
　　1.DBM-LBL-rFN/CDH制備及體外檢測:通過聚乙烯亞胺提供初始電荷，以殼聚糖為陽離子，rFN/CDH為陰離子，層層自組裝構(gòu)建多層rFN

6、/CDH融合蛋白修飾界面。通過接觸角檢測觀察支架材料表面化學(xué)成分改變確定修飾方案;通過X線光電子能譜(XPS)分析修飾前后材料表面元素組成變化;通過掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)及孔徑變化;液體位移法檢測材料孔隙率變化;rFN/CDH融合蛋白免疫熒光觀察蛋白在支架材料表面分布情況，震蕩漂洗實驗檢測支架材料穩(wěn)定性;將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stem cells，hBMSCs)接種至支架材料表面，計算接種細(xì)胞上

7、架率，連續(xù)培養(yǎng)3天、7天后，細(xì)胞骨架染色、CCK-8法觀察細(xì)胞在支架材料表面增殖情況;接種細(xì)胞后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，Western Blot檢測骨鈣素(osteocalcin)、骨橋蛋白(osteoponin)等成骨標(biāo)記表達情況。
　　2.DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集效率及其對BMSCs遷移、增殖和成骨分化的影響:SCR構(gòu)建DBM-LBL-rFN/CDH富集骨髓組織工程骨，流式細(xì)胞術(shù)檢測SCR過程中材料富集的細(xì)胞組成，蛋白質(zhì)芯

8、片和ELISA檢測富集材料中成骨相關(guān)細(xì)胞因子水平;提取富集后支架材料總蛋白制備細(xì)胞遷移條件培養(yǎng)基、細(xì)胞增殖條件培養(yǎng)基、成骨分化條件培養(yǎng)基。以細(xì)胞遷移條件培養(yǎng)基構(gòu)建hBMSCs體外遷移trans-well模型，檢測支架材料富集的細(xì)胞及因子對hBMSCs遷移的影響;以細(xì)胞增殖條件培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs，CCK-8法檢測富集材料細(xì)胞增殖的影響;以成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化，RT-PCR、WB檢測堿性磷酸酶(alkaline p

9、hosphatase，ALP)、OCN、OPN等成骨標(biāo)記表達情況，評價富集材料富集的細(xì)胞及因子對hBMSCs成骨分化的影響。
　　3.DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料體內(nèi)成骨效應(yīng)及其募集宿主細(xì)胞參與成骨效應(yīng)研究:用DBM-LBL-rFN/CDH骨髓富集材料修復(fù)FVB/N小鼠股骨缺損模型，術(shù)后4周，Micro-CT、HE染色及masson染色評價成骨情況，扭轉(zhuǎn)實驗和三點彎曲實驗評價骨缺損修復(fù)后生物力學(xué)強度;術(shù)后通過尾靜脈注

10、射綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse BMSCs，mBMSCs)，術(shù)后3天取植骨區(qū)標(biāo)本，ELISA檢測植骨區(qū)SDF-1α濃度，免疫熒光檢測富集后組織工程骨募集BMSCs的能力。
　　結(jié)果:
　　1.材料修飾8層后隨著修飾層數(shù)增加，接觸角呈規(guī)律的波動在34°(rFN/CDH)至45°(Chi)之間，提示材料表面組成已趨于穩(wěn)定，為確保修飾界面在SCR及植入體內(nèi)后持續(xù)發(fā)揮作用，我們將修飾12層的界面(即PEI-rF

11、N/CDH-(Chi-rFN/CDH)5)確認(rèn)為最終修飾方案，并以LBL-rFN/CDH指代;XPS檢測表面元素組成結(jié)果提示，DBM表面主要為碳元素（90.48±0.19％），當(dāng)修飾材料最外層為Chi時表面碳、氮、氧元素含量分別為51.63±0.64％、15.42±0.2％、32.31±0.35％，而最外層為rFN/CDH時，分別為45.91±0.61％、18.47±0.29％、34.40±0.19％，支架材料表面元素組成隨修飾過程明顯

12、改變;DBM支架材料表面光滑，修飾后的支架材料表面形成大量不規(guī)則凸起，材料孔隙內(nèi)部形成新的小孔，平均孔徑由463±110μm下降至246±87μm; DBM-LBL-rFN/CDH孔隙率為0.620±0.152，與DBM(0.660±0.153)無明顯差異;免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)強力震蕩漂洗前后DBM-LBL-rFN/CDH材料表面蛋白含量均明顯多于單純浸泡的DBM-rFN/CDH支架材料，提示材料修飾高效且穩(wěn)定;修飾后的支架材料接種hBMS

13、Cs細(xì)胞上架率71.2±5.9％，顯著高于DBM組（54.0±3.7％），具有更強的粘附性;接種BMSCs培養(yǎng)3天和7天后，細(xì)胞骨架染色和CCK-8檢測提示DBM-LBL-rFN/CDH支架材料表面顯著多于DBM組，表明LBL-rFN/CDH可促進MSCs增殖;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，DBM-LBL-rFN/CDH組細(xì)胞OCN、OPN等表達明顯強于DBM組，表明LBL-rFN/CDH可提供良好的促成骨微環(huán)境。
　　2.DBM-LBL-rF

14、N/CDH支架材料有核細(xì)胞富集率和富集倍數(shù)(29.35±1.69％、2.80±0.16)顯著高于DBM組（18.55±1.47％和1.69±0.13），封閉骨髓細(xì)胞表面識別RGD序列的整合素后，富集率和富集倍數(shù)下降至23.70±1.87％和2.29±0.18;DBM-LBL-rFN/CDH富集的有核細(xì)胞中，識別RGD的整合素(α3和αV)陽性細(xì)胞比例為60.51±4.11％和32.72±3.89％，明顯高于DBM組（48.13±2.89

15、％和21.89±2.26％），封閉整合素后，該比例下降至(49.97±5.04％和25.38±2.42％);成骨相關(guān)的BMSCs、造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞變化趨勢也與此相類似。細(xì)胞因子芯片和ELISA檢測結(jié)果提示富集骨髓后DBM-LBL-rFN/CDH支架材料中CXCL3、IFN-γ、 bFGF、BMP-2、BMP-6、MDC、SDF-1α、PDGF-BB等成骨相關(guān)因子明顯多于DBM組和DBM/SAP組。DBM-LBL-rFN/CDH富集后

16、材料蛋白提取物較DBM組和DBM/SAP組具有更強的促進細(xì)胞遷移、增殖和成骨分化的能力。
　　3.綠色熒光蛋白特異性免疫熒光和小動物成像結(jié)果均證實DBM-LBL-rFN/CDH植入體內(nèi)后可募集更多的尾靜脈注射的mBMSCs，同時材料局部SDF-1α濃度明顯高于DBM組和DBM/SAP組，提示富集骨髓的DBM-LBL-rFN/CDH復(fù)合物可募集宿主細(xì)胞促進骨修復(fù)。影像學(xué)檢查、生物力學(xué)測試、HE和Masson染色均證實修復(fù)臨界骨缺損具