選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)快速構(gòu)建組織工程骨在山羊脊柱融合成骨效應(yīng)的研究.pdf

1、背景:因現(xiàn)代戰(zhàn)爭及和平時期交通、建筑等行業(yè)的高能量損傷、骨腫瘤切除、骨結(jié)核與感染等所致的骨缺損日益常見。作為治療骨缺損金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植,由于存在取骨量有限和取骨區(qū)并發(fā)癥,已不能滿足骨缺損治療的需要。利用骨髓干細(xì)胞與生物材料結(jié)合構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)骨缺損的動物實驗已獲得較為肯定的效果,但其缺點在于MSCs來源少、體外培養(yǎng)擴(kuò)增周期長、技術(shù)條件高,從而影響了其在骨缺損治療中的應(yīng)用。自體紅骨髓經(jīng)皮注射在臨床治療骨不連和填充骨缺損等方面已取得一

2、定的成功,但應(yīng)用直接注入的方法,局部干細(xì)胞容易流失,影響了療效。SCR是近年來歐美學(xué)者報道的骨髓干細(xì)胞富集技術(shù)之一,主要是通過基質(zhì)材料適當(dāng)?shù)木W(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和良好的表面黏附性能,使骨髓流經(jīng)時選擇性滯留利于成骨的干細(xì)胞及促成骨因子等成分,所構(gòu)建的TEB即刻回植修復(fù)骨缺損,可獲得較理想的成骨效果。但由于受到知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和入關(guān)限制的影響,該技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品至今難以在我國臨床應(yīng)用。為了SCR技術(shù)能在我國推廣應(yīng)用,本課題組在前期實驗已經(jīng)對經(jīng)PLL修飾的人D

3、BM作為富集基質(zhì)材料的性能進(jìn)行了檢測,同時觀察其在裸鼠皮下的成骨效果,并發(fā)現(xiàn)其在裸鼠皮下的成骨效果與體外常規(guī)構(gòu)建的組織工程骨相當(dāng)。
　　 目的:
　　 (1)在前期工作的基礎(chǔ)之上,驗證經(jīng)PLL修飾的DBM富集基質(zhì)材料通過SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB在山羊橫突間融合模型的成骨效果。
　　 (2)初步探討SCR技術(shù)快速構(gòu)建TEB的成骨機(jī)制。
　　 (3)SCR技術(shù)骨髓富集裝置的制備及其優(yōu)化參數(shù)的測定。
　　

4、 方法:
　　 (1)青山羊PLL-DBM材料的制備。采用多聚左旋賴氨酸修飾青山羊脫鈣骨基質(zhì)制備一種骨髓干細(xì)胞富集基質(zhì)材料,用X射線能譜分析材料鈣磷的含量、掃描電鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)、氨基酸成分分析檢測PLL與DBM的復(fù)合情況、并對其生物力學(xué)性能進(jìn)行檢測。
　　 (2)成骨能力觀察。應(yīng)用SCR技術(shù)術(shù)中富集骨髓細(xì)胞快速構(gòu)建TEB,在青山羊橫突間融合模型上觀察其成骨能力。將24只山羊隨機(jī)分成兩組(Ⅰ組和Ⅱ組),每組12只。骨移植

5、材料分為如下四組:ⅠA組:PLL-DBM富集骨髓后構(gòu)建的TEB;ⅠB組:等量自體髂骨;ⅡC組:DBM骨髓浸泡;ⅡD組:空白DBM。將ⅠA組和ⅠB組移植材料分別植入第1組山羊個體的腰3/4左右橫突間隙;ⅡC組和ⅡD組移植材料分別植入第Ⅱ組山羊個體的腰3/4左右橫突間隙。分別于術(shù)后第8、16周分批處死山羊,取融合段標(biāo)本行X線片及X線評分、三維CT及CT值檢測、組織學(xué)觀察及評分、生物力學(xué)性能檢測,評價其成骨能力。
　　 (3)成骨機(jī)制

6、的探討。①應(yīng)用SCR技術(shù)使骨髓流經(jīng)PLL-DBM材料構(gòu)建TEB,通過纖維母細(xì)胞集落形成單位計數(shù)計算PLL-DBM材料對骨髓干細(xì)胞的富集效果,ELISA法檢測富集前后骨髓上清中PDGF、IGF-Ⅰ因子表達(dá)。②采用SCR技術(shù)使PLL-DBM富集骨髓后快速構(gòu)建TEB,然后將構(gòu)建的TEB持續(xù)冷凍干燥36h去掉細(xì)胞成分,分別將SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB(SCR組)、冷凍干燥去細(xì)胞的TEB(FTEB組)、單純DBM(DBM組)植入裸鼠皮下,分別于4、8

7、天取材,HE染色觀察組織塊上所募集的細(xì)胞情況,于第4、8、12周應(yīng)用X線攝片觀察植骨處影像密度、術(shù)后12周進(jìn)行CT掃描并計算植骨區(qū)CT值、HE染色觀察植骨區(qū)組織學(xué)改變和成骨效果。
　　 (4)骨髓富集裝置的制備及其優(yōu)化參數(shù)的測定。根據(jù)SCR技術(shù)原理,自行設(shè)計研制骨髓富集裝置;應(yīng)用SCR技術(shù)使骨髓流經(jīng)富集基質(zhì)材料,通過檢測富集前后PLL-DBM對骨髓有核細(xì)胞的富集效果,確定最佳循環(huán)次數(shù)以及骨髓的流速。
　　 結(jié)果:

8、　　 (1)X射線能譜分析顯示單純DBM及PLL-DBM材料均沒有明顯的鈣磷特征波峰;氨基酸成分分析顯示PLL-DBM及單純DBM中膠原類氨基酸(GlY、Arg、Lys)含量均高,而無明顯色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和半光氨酸(Cys)等強(qiáng)抗原性氨基酸波峰,二者相比無明顯差異,但PLL-DBM較單純DBM有明顯的賴氨酸(Lys)波峰;PLL在材料內(nèi)外表面形成均勻的乳白色涂層,PLL-DBM孔隙率為(70±6)％,孔徑為472.5

9、1±7.02μm,孔與孔之間有約100μm左右小孔貫通,孔隙內(nèi)部有大量孔隙相互連通,并形成蜘蛛網(wǎng)樣的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu);生物力學(xué)性能檢測顯示當(dāng)材料發(fā)生60％壓縮形變時,PLL-DBM材料在最大載荷、抗壓強(qiáng)度明顯較DBM低(n=10,P=0.022,P=0.012),而在彈性模量二者沒有明顯差異(n=10,P=0.225)。
　　 (2)X線顯示:術(shù)后第8周時ⅠA組融合范圍不如ⅠB組寬,只是在內(nèi)側(cè)靠近椎體處有較多的成骨,但明顯較ⅡC組成骨明

10、顯,ⅡD組無明顯成骨;第16周ⅠA組、ⅠB組的融合范圍基本相當(dāng),均完全愈合,骨密度與橫突的骨密度基本一致;ⅡC的融合范圍明顯較ⅠA組、ⅠB組窄,只是在內(nèi)側(cè)靠近椎體的位置有部分融合:ⅡD組基本無融合,只是在橫突間存在島狀的成骨片。X評分第8周ⅠA組為7.17±1.17(n=6),明顯低于ⅠB組的9.00±1.10(n=6,P＜0.05),但明顯高于ⅡC的5.00±0.89(n=6)和ⅡD組的2.00±1.10(n=6);到術(shù)后第16周時,

11、ⅠA組與ⅠB組的評分分別是10.00±1.79、11.00±1.67,二者無明顯差異(n=6,P＞0.05),但明顯高于ⅡC、ⅡD組。第16周三維CT顯示:ⅠA、ⅠB組的CT值分別是696.76±102.75、766.03±69.24,二者無明顯差異(n=6,P＞0.05),均明顯高于較ⅡC組的488.63±76.40(n=6,P＜0.01),ⅡC組CT。值高于D組的91.83±31.87(n=6,P＜0.01)。組織學(xué)評分顯示與X線評

12、分類似的結(jié)果。術(shù)后第16周取移植材料融合段行生物力學(xué)性能檢測,結(jié)果顯示:ⅠA、ⅠB組在最大載荷、抗彎強(qiáng)度比較均無明顯差異(n=6,P＞0.05),ⅠA組較C組高(n=6,P＜0.01,P＜0.05),ⅠB組較ⅡC組高(n=6,P＜0.01,P＜0.01),ⅡC組明顯較ⅡD組高(n=6,P＜0.01)。
　　 (3)纖維母細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)計數(shù)顯示PLL-DBM材料對骨髓干細(xì)胞的濃度富集倍數(shù)為5.68±0.49倍,而未

13、經(jīng)PLL修飾的DBM的富集倍數(shù)僅為2.23±0.27倍,二者有顯著異(n=4,P＜0.01)。PLL-DBM材料對PDGF、IGF-I兩種因子的濃度富集倍數(shù)分別是13.624±1.251,36.311±5.562(n=4)。
　　 (4)裸鼠皮下成骨實驗觀察到,術(shù)后第4天組織塊HE染色,SCR組及FTEB組置入材料上均可見較多的由植入?yún)^(qū)周圍募集到組織塊上的有核細(xì)胞,第8天組織塊上募集的細(xì)胞更多。術(shù)后第4周三組均沒有明顯的骨顯影,

14、第8周SCR組以及FTEB組已經(jīng)有較明顯的骨顯影,空白DBM組部分吸收,第12周X線片顯示SCR組和FTEB組植入物呈現(xiàn)高密度的鈣化影像,DBM組未見高密度影像出現(xiàn),植入材料基本吸收,CT結(jié)果顯示SCR組成骨區(qū)CT值為(687.67±18.55)HU(n=6),FTEB組成骨區(qū)CT值為(674.33±12.21)HU(n=6),DBM組成骨區(qū)CT值為(57.88±5.47)HU(n=6)、組織學(xué)觀察均顯示FTEB組具有與SCR組相當(dāng)?shù)某?/p>

15、骨能力,空白DBM組材料已經(jīng)基本吸收,沒有類骨組織形成。
　　 (5)自制富集器最優(yōu)化的組合功能參數(shù)為:循環(huán)次數(shù)4次/骨髓流速為(100ml/3分鐘),更多的循環(huán)次數(shù)與更慢的骨髓流速組合參數(shù)并不表現(xiàn)出更佳的富集效果。
　　 結(jié)論:
　　 (1)制備的同種異體青山羊PLL-DBM材料具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)和促進(jìn)細(xì)胞黏附的PLL,生物力學(xué)彈性模量好,是一種較理想的骨髓干細(xì)胞富集基質(zhì)材料。
　　 (2)SCR技

16、術(shù)快速制備的TEB具有高成骨活性,在山羊脊柱橫突間融合模型中成骨能力與自體骨相當(dāng)。
　　 (3)應(yīng)用SCR技術(shù)能使基質(zhì)材料PLL-DBM中富集較高濃度的骨髓干細(xì)胞,同時能富集較高濃度的骨生長因子。
　　 (4)基質(zhì)材料中所富集的骨髓干細(xì)胞和骨生長因子通過其自身的作用以及募集受體植骨區(qū)周圍的細(xì)胞和生長因子共同參與成骨。
　　 (5)SCR技術(shù)快速構(gòu)建的TEB經(jīng)去細(xì)胞處理后仍然具有較高的成骨活性,說明富集基質(zhì)材料上所