蛋黃蛋白質(zhì)多肽的制備及其促成骨活性的研究.pdf

1、蛋黃中含有豐富的蛋白質(zhì)，通過蛋白酶水解制備得到蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(EYPH)，其中含有大量的生物活性功能物質(zhì)，據(jù)報(bào)道EYPH具有抗氧化、降血壓、與礦物結(jié)合等活性。本論文主要以制備EYPH為研究對(duì)象，首先通過篩選最適蛋白酶及優(yōu)化水解條件制備EYPH，進(jìn)而研究EYPH對(duì)于成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化及礦化的影響反應(yīng)其對(duì)骨礦化的影響，為開發(fā)促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的功能食品提高理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論為:
　　對(duì)于骨生成細(xì)胞模型小鼠顱頂前成骨細(xì)

2、胞亞克隆14(MC3T3-E1)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。以4種蛋白酶水解蛋黃蛋白質(zhì)得到水解產(chǎn)物按不同濃度加入MC3T3-E1培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，發(fā)現(xiàn)了水解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力促進(jìn)效果與產(chǎn)物濃度無劑量關(guān)系，濃度過高對(duì)成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用降低。比較4種水解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響，最后得出胰蛋白酶制備的EYPH對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力促進(jìn)效果最好，細(xì)胞增殖活力為130.27％，其次為風(fēng)味蛋白酶制備的EYPH，細(xì)胞增殖

3、活力為123.69％。
　　將胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了水解產(chǎn)物的水解度(DH)隨水解時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，DH高不一定產(chǎn)物活性強(qiáng)，水解6h時(shí)所得的水解產(chǎn)物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率促進(jìn)效果最強(qiáng)，其水解度為18.6％。以MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力為指標(biāo)對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，將兩種蛋白酶水解條件分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，后進(jìn)行兩種酶復(fù)配的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單一的胰蛋白酶反應(yīng)得到水解產(chǎn)物活性最好，最佳的水解條件為:水解

4、時(shí)間6h、水解溫度37℃、酶與底物比1∶50、水解pH8.0。
　　胰蛋白酶在最佳水解條件下制備得EYPH，探究EYPH對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)EYPH能夠有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，在1 mg/mL濃度下細(xì)胞增殖效果最佳，細(xì)胞增殖活力最高為129.87％。在EYPH的刺激下，成骨細(xì)胞處于S期的細(xì)胞含量顯著增加，進(jìn)一步說明EYPH可有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖。通過成骨細(xì)胞中ALP活

5、力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)EYPH對(duì)成骨細(xì)胞分化有顯著促進(jìn)作用，在刺激7d條件下，ALP活力提高9.1％。通過熒光定量RT-PCR測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞分化階段成骨相關(guān)基因(Runx2、ALP、OC)的表達(dá)量，進(jìn)一步證實(shí)了EYPH對(duì)成骨細(xì)胞分化有顯著促進(jìn)作用。采用茜蘇紅染色得到EYPH對(duì)成骨細(xì)胞礦化有促進(jìn)作用，且1 mg/mL濃度組要優(yōu)于2mg/mL濃度組。從這一系列的結(jié)果可以推出EYPH擁有促骨生長(zhǎng)活性。
　　通過Superdex pept

6、ides凝膠柱及超濾的方法對(duì)EYPH進(jìn)行分離，比較不同組分對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖及分化的影響。研究得到水解產(chǎn)物中對(duì)成骨細(xì)胞活性最強(qiáng)的物質(zhì)分子量在10-30kDa之間。經(jīng)氨基酸分析儀分析，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化影響最大的組分中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸及精氨酸這8種氨基酸含量比水解產(chǎn)物組中的含量高。通過MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果顯示兩個(gè)組分中含有大量共有肽段，其中高豐度的共有肽段為 A