Sema3A參與前列腺癌介導的促成骨分化的機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　超過90％的惡性腫瘤患者會出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,而且其中超過90%的死因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關。骨骼系統(tǒng)是腫瘤患者體內(nèi)瘤細胞的常發(fā)轉(zhuǎn)移部位。前列腺癌和乳腺癌是轉(zhuǎn)移性腫瘤的常見病因。此外,其他類型腫瘤如肺癌、腎臟及甲狀腺腫瘤也會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。晚期腫瘤轉(zhuǎn)移至骨將會引起一些嚴重的并發(fā)癥,比如嚴重的骨痛,通常這類疼痛對治療不敏感,還有脊髓壓迫、病理性骨折和高鈣血癥。前列腺癌患者多死于腫瘤轉(zhuǎn)移性骨疾病(Metastatic bone d

2、isease,MBD),這類疾病通過放射顯影技術觀察通常會表現(xiàn)出明顯的對骨組織呈成骨性,而非溶骨性的破壞。這通常是由于前列腺癌細胞侵入至骨髓微環(huán)境,影響了骨形成和骨吸收的平衡,且介導了成骨細胞的過度活化所造成的。
　　大量的研究發(fā)現(xiàn),骨轉(zhuǎn)移后的前列腺癌細胞通過分泌促成骨性因子刺激成骨前體細胞活化。WNT信號因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等信號蛋白能夠促進各種成骨前體細胞,如MC3T3-E1(鼠源性前體成骨細

3、胞亞克隆系)細胞以及骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)向成熟成骨細胞分化。WNT信號蛋白是一種糖脂類信號分子,通過目標細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導蛋白β-catenin發(fā)揮促進成骨成熟的作用。β-catenin最早發(fā)現(xiàn)其參與α-catenin以及cadherin的黏著連接,但此后因作為WNTs的信號轉(zhuǎn)導共活化因子而被廣泛熟知。經(jīng)典WNT配體通過與其受體復合物,包括FZD蛋白家族的七次跨膜受體以及LRP5或LRP6,激活WNT/β-catenin信號通路,

4、來自WNTs的信號能夠抑制β-catenin的降解,保證后者呈穩(wěn)定狀態(tài),并能夠轉(zhuǎn)位至胞核與TCF/LEF蛋白結(jié)合,進而激活WNTs目標基因的轉(zhuǎn)錄。此外,WNT配體還能夠促進成骨細胞中BMP2的表達,后者被證明同樣對成骨分化有重要的促進作用。由此可見WNT/β-catenin對成骨分化起到關鍵的調(diào)節(jié)作用。但前列腺癌細胞通過分泌何種促成骨因子進而調(diào)節(jié)WNT/β-catenin通路參與促成骨作用的相關機制研究并不透徹。
　　近期有研究發(fā)

5、現(xiàn),Semaphorins家族中Semaphorin3A(Sema3A),能夠刺激成骨性的骨礦化,表現(xiàn)出明顯的骨保護特性,其生物學功能的發(fā)揮是依靠與其特異性受體NRP1連接而實現(xiàn)的。但目前仍然缺乏前列腺癌細胞是否通過分泌Sema3A介導成骨細胞內(nèi)WNT/β-catenin通路進而促進成骨分化的相關研究。
　　研究方法:
　　我們觀察不同前列腺癌細胞對成骨前體細胞MC3T3-E1成骨分化的影響,為后續(xù)機制學研究建立前列腺癌與成

6、骨前體細胞共培養(yǎng)模型,并檢測各型前列腺細胞系中Sema3A表達的差異。而后,我們著重研究前列腺癌細胞C4-2是否能夠分泌Sema3A參與促成骨分化的機制。最后,我們檢測前列腺癌細胞來源的Sema3A對成骨前體細胞內(nèi)WNT/β-catenin信號通路,重點是對β-catenin活化的影響。
　　一、體外共培養(yǎng)模型的建立以及各型前列腺癌細胞系中Sema3A的表達差異
　　1.收集各前列腺癌細胞系的條件培養(yǎng)基(CM),分組,分別刺

7、激成骨前體細胞MC3T3-E1在成骨誘導培養(yǎng)基中分化。分別于實驗第3天收集各實驗組細胞測定堿性磷酸酶(ALP)活性,并做ALP染色,第14或第21天利用茜素紅染色觀察實驗細胞礦化成熟程度;并在實驗第14天利用qPCR技術檢測各實驗組細胞成骨相關標志性基因Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1 mRNA的相對表達量。
　　2.利用Western-blot蛋白印跡分析以及細胞免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察各型前列腺癌細胞系中Sema3

8、A的表達差異。
　　二、Sema3A/NRP1在前列腺癌介導的促成骨分化中作用機制的研究
　　利用攜帶干擾Sema3A表達shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系C4-2(該細胞系在前述實驗中被證明能夠明顯促進成骨分化),或Sema3A特異性中和抗體處理其CM,制備如下4種條件培養(yǎng)基:C4-2成骨條件培養(yǎng)基、C4-2-Sema3A成骨條件培養(yǎng)基、C4-2NC成骨條件培養(yǎng)基、成骨誘導培養(yǎng)基,或另外4種:C4-2成骨條件培養(yǎng)基, C

9、4-2Sema3A Ab成骨條件培養(yǎng)基, C4-2IgG成骨條件培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基。進過共培養(yǎng)3天或14天,收集實驗細胞,進行如下實驗:
　　1.利用ALP活性檢測和BCIP/NBT染色法檢測各組細胞ALP活性。
　　2.利用茜素紅S染色檢測各種細胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況。
　　3.利用qPCR技術檢測各組細胞Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相對表達量。
　　4.利用Western-blot

10、蛋白印跡法檢測實驗細胞表面Sema3A特異性受體NRP1的表達,以及細胞質(zhì)中活性狀態(tài)的β-catenin的表達差異。
　　實驗結(jié)果:
　　一、體外共培養(yǎng)模型的鑒定
　　1. C4-2細胞和LNCaP細胞條件培養(yǎng)基能夠顯著促進成骨前體細胞MC3T3-E1中ALP的活化以及礦化形成程度(P<0.05)。相反PC-3細胞條件培養(yǎng)基對上述過程卻呈抑制作用(P<0.05)。
　　2.含C4-2細胞條件培養(yǎng)基(20%,v/v

11、)的成骨誘導培養(yǎng)基能夠明顯促進MC3T3-E1細胞分化過程中成骨相關標志基因Col1α1, OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相對表達量(P<0.05)。
　　二、Sema3A的表達
　　1.細胞免疫熒光檢測:
　　使用Sema3A的特異性一抗以及標記FITC熒光素的二抗探針檢測各型前列腺癌細胞系中的Sema3A,其中C4-2細胞中指示Sema3A表達的綠色熒光最明顯。
　　2.Western-blot蛋白

12、印跡法:
　　抽提各型前列腺癌細胞系的總蛋白,并利用Sema3A特異性抗體檢測其表達。其中,C4-2細胞中Sema3A蛋白印跡灰度值最高。
　　三、Sema3A/NRP1在前列腺癌介導的促成骨分化中作用機制的研究1.成骨分化:
　　1)堿性磷酸酶的活性:與陽性對照組相比,C4-2條件培養(yǎng)基處理過后MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶活性明顯增強(P<0.05),但在使用慢病毒靜默Sema3A在C4-2細胞中表達,或是使用中和

13、抗體下調(diào)Sema3A在C4-2細胞條件培養(yǎng)基中含量后,其與正常對照相比,無顯著差異。
　　2)礦化實驗:使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,先前因使用C4-2細胞條件培養(yǎng)基促進而大量形成的骨鈣化結(jié)節(jié)又明顯減少,而且骨鈣化面積也明顯縮小(P<0.05)。
　　3)成骨相關基因表達:C4-2細胞條件培養(yǎng)基可促進成骨分化相關基因Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA高表達(P<0.05),但使用s

14、hRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,上述成骨相關基因mRNA相對表達量與陽性對照組相比無明顯差異。
　　2.特異性受體NRP1在成骨細胞表面的表達:
　　使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,NRP1在MC3T3-E1表面表達量明顯降低(P<0.05)。
　　3.MC3T3-E1細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的活化檢測:
　　成骨細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的活化受C4-2細胞條件培養(yǎng)基

15、影響,在共培養(yǎng)0h、48h及96h后利用Wester-blot法檢測蛋白表達,發(fā)現(xiàn)β-catenin的活化呈時間依賴性增強,與刺激時間呈正相關(P<0.05)。
　　使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗體后,在成骨誘導過程中MC3T3-E1細胞質(zhì)中穩(wěn)定活化狀態(tài)的β-catenin表達量明顯減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　一、Sema3A在高轉(zhuǎn)移性的、具有明顯促成骨活性的前列腺癌細胞系中高表達。