乳酸調(diào)控“骨-軟骨”組織成分細(xì)胞的效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、骨和軟骨損傷是常見的運動系統(tǒng)疾患，組織工程技術(shù)構(gòu)建人工骨和軟骨，以及再生醫(yī)學(xué)技術(shù)促進(jìn)骨和軟骨再生是其有效治療方法。Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)和poly-L-lactate acid(PLLA)等乳酸基質(zhì)材料是骨-軟骨損傷修復(fù)與再生常用的支架材料和藥物載體，乳酸是其合成的基質(zhì)材料也是其體內(nèi)降解的主要產(chǎn)物。有研究顯示PLGA和PLLA的降解產(chǎn)物可影響“骨-軟骨”組織功能，但是乳酸在“骨-軟骨”組織

2、中的功能尚不清楚。本課題將研究乳酸對軟骨細(xì)胞(骨關(guān)節(jié)炎(OA)及正常軟骨細(xì)胞）以及骨組織細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，MSC）的作用。研究共分2部分：
　　1、乳酸影響軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的研究
　　以生物材料為支架的組織工程再生技術(shù)和自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)是治療軟骨缺損的有效方法，但這兩種技術(shù)都存在缺陷:PLGA和PLLA等常用生物支架降解后影響軟骨功能;軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)易發(fā)生去表型丟失。本實驗研究PLGA和PLLA的主要降解產(chǎn)物乳酸對O

3、A軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及其機制，為后期優(yōu)化用于軟骨再生的PLGA和PLLA支架材料設(shè)計提供理論支持;以乳酸作用于體外培養(yǎng)的正常軟骨細(xì)胞，檢測其對軟骨細(xì)胞表型維持的作用，為軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)表型維持提供新方法。
　　1.1 適宜乳酸作用抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的病理進(jìn)程
　　我們檢測了不同分子量的PLGA和PLLA降解液中乳酸的濃度，并以降解液作用于人軟骨細(xì)胞，檢測其對軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)蛋白基因表達(dá)的作用;以不同濃度和時間的乳酸作用于

4、人正常及OA軟骨細(xì)胞，檢測細(xì)胞的功能變化;將乳酸分別以脈沖式和一次性模式作用于軟骨細(xì)胞，優(yōu)化其最佳作用效果;采用基因芯片篩選并基因敲降方法，驗證乳酸調(diào)控細(xì)胞功能的可能機制。具體研究內(nèi)容如下:
　　第一部分、PLGA和PLLA降解液對人軟骨細(xì)胞的作用。主要發(fā)現(xiàn):1）不同分子量PLGA和PLLA降解液對軟骨細(xì)胞增殖和COL2A1和ACAN的表達(dá)作用不同。2）不同分子量PLGA和PLLA降解液中乳酸濃度和pH值不同，分子量越小，乳酸濃度

5、越高，pH值越低。
　　第二部分、乳酸對人軟骨細(xì)胞的作用。主要發(fā)現(xiàn):乳酸對人軟骨細(xì)胞的作用呈時間和濃度依賴性，短時高濃度乳酸可促進(jìn)COL2A1和ACAN的表達(dá);并且短時高濃度乳酸還可抑制ADAMTS5的表達(dá)。
　　第三部分、乳酸不同作用模式對軟骨細(xì)胞的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3天中每天1次，每次8小時的乳酸脈沖式作用模式，相比3天僅給予1次8小時乳酸的一次性作用模式，可顯著上調(diào)COL2A1的表達(dá)。
　　第四部分、乳酸對軟骨細(xì)胞的

6、作用機制。主要發(fā)現(xiàn):1）通過基因芯片篩查乳酸作用后軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)和生物過程變化，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子1A(hypoxiainducible factor1A,HIF1A)下游調(diào)控基因差異顯著，提示HIF1A參與調(diào)控乳酸對軟骨細(xì)胞的作用。2）通過敲降HIF1A及其家族成員低氧誘導(dǎo)因子2A(hypoxiainducible factor2A，HIF2A)方法，發(fā)現(xiàn)乳酸的作用主要由HIF1A介導(dǎo)而非HIF2A;且發(fā)現(xiàn)乳酸調(diào)控的HIF1A蛋白表

7、達(dá)增強主要是由于上調(diào)其基因表達(dá)，而非抑制其蛋白降解。
　　上述結(jié)果表明，適宜的乳酸作用可通過上調(diào)COL2A1和抑制ADAMTS5的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài);設(shè)計用于軟骨再生的PLGA和PLLA材料時需考慮降解產(chǎn)物乳酸的影響。
　　1.2 適宜乳酸作用促進(jìn)體外培養(yǎng)的正常軟骨細(xì)胞的表型維持
　　我們以1.1中篩選的乳酸最佳作用濃度和時間作用于人軟骨細(xì)胞，檢測其對軟骨細(xì)胞表型維持的作用;從乳酸調(diào)控軟骨細(xì)胞糖酵解代謝角度，闡釋

8、乳酸促進(jìn)表型維持的機制。具體研究內(nèi)容如下:
　　第一部分、乳酸對軟骨細(xì)胞表型維持的作用。主要發(fā)現(xiàn):原代軟骨細(xì)胞傳代過程中COL2A1、ACAN和SOX9的表達(dá)持續(xù)下降，乳酸作用可上調(diào)COL2A1、ACAN和SOX9的表達(dá)，維持軟骨細(xì)胞表型。
　　第二部分、乳酸維持軟骨細(xì)胞表型的機制。主要發(fā)現(xiàn):1）乳酸可上調(diào)軟骨細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因表達(dá)。2）軟骨細(xì)胞表型與糖酵解相關(guān):低氧和TGF-β3作用可上調(diào)糖酵解，傳代過程中糖酵解下調(diào)。3）

9、抑制糖酵解后，乳酸調(diào)控軟骨細(xì)胞表型的功能下降。
　　上述結(jié)果表明，乳酸可通過上調(diào)糖酵解促進(jìn)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的表型維持。
　　2、乳酸調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新能力的研究
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨組織的主要前體細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的一個顯著特征是具有自我更新能力，研究顯示細(xì)胞代謝可通過不同的代謝中間產(chǎn)物調(diào)控干細(xì)胞自我更新能力。乳酸是PLGA、PLLA的降解產(chǎn)物，也是細(xì)胞無氧酵解代謝的主要終產(chǎn)物，其對于細(xì)胞的自我更

10、新能力的調(diào)控尚不清楚。本實驗研究乳酸對于細(xì)胞自我更新能力的作用，并從KDM6B調(diào)控糖酵解角度探討乳酸調(diào)控干細(xì)胞的自我更新能力的機制，以增加乳酸調(diào)控干細(xì)胞功能的新認(rèn)識。具體研究內(nèi)容如下:
　　第一部分、乳酸對hMSC的增殖與自我更新能力的作用。主要發(fā)現(xiàn):1）乳酸抑制hMSC的增殖。2）低濃度乳酸促進(jìn)hMSC的自我更新能力。3）乳酸促進(jìn)hMSC干性基因表達(dá)。
　　第二部分、乳酸調(diào)控hMSC自我更新能力的機制（乳酸對糖酵解的調(diào)控）

11、。主要發(fā)現(xiàn):1）乳酸可上調(diào)hMSC糖酵解。2）調(diào)控糖酵解可影響hMSC的自我更新能力:上調(diào)糖酵解可促進(jìn)hMSC的自我更新能力，下調(diào)糖酵解可抑制hMSC的自我更新能力。3）抑制糖酵解后，乳酸調(diào)控hMSC的自我更新能力下降。
　　第三部分、乳酸對糖酵解的調(diào)控機制（乳酸對KDM6B的調(diào)控）。主要發(fā)現(xiàn):
　　1)乳酸可上調(diào)KDM6B的表達(dá)。2）KDM6B調(diào)控hMSC糖酵解和自我更新能力:KDM6B敲降可下調(diào)hMSC糖酵解，KDM6B