Lactococcus lactis有氧呼吸末期乳酸利用酶的鑒定及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的乳品微生物，廣泛用于多種干酪、酪乳、發(fā)酵黃油的生產(chǎn)中。研究表明L.lactis在添加血紅素的有氧條件下可以進(jìn)行呼吸代謝，獲得的菌體生長存活性能較比常規(guī)的發(fā)酵代謝都有大幅的提高。L.lactis有氧呼吸代謝中最獨(dú)特的一個(gè)特征是，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗盡時(shí)菌體可以將環(huán)境中的乳酸代謝掉同時(shí)乙偶姻、聯(lián)乙醯、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)大量積累，菌體生物量也繼續(xù)提高，這

2、些特征對于L.lactis的生產(chǎn)及應(yīng)用來說是非常有價(jià)值的。然而至目前為止，科學(xué)界對L.lactis細(xì)胞內(nèi)能夠催化乳酸氧化的酶系以及調(diào)控乳酸合成-消耗的機(jī)制尚無任何相關(guān)報(bào)道。因此，本研究的目的就是要探尋L.lactis中催化乳酸利用的酶系并闡明調(diào)控乳酸代謝的機(jī)制。
　　 本課題分為四大部分。首先用生物信息學(xué)的方法初步篩選出可能在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化利用的酶系;然后通過測定在L.lactis有氧呼吸及發(fā)酵培養(yǎng)物粗

3、酶中不同類型酶的活性而初步判斷出哪種類型的酶占優(yōu)勢;繼而在體外表達(dá)潛在的利用乳酸的酶并用純化的重組蛋白進(jìn)一步深入研究其乳酸氧化活性的大小以及調(diào)節(jié)其生理活性與乳酸氧化活性的機(jī)制;最后，對比發(fā)生乳酸氧化之前和之后的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物的濃度，以驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化是否有利于這種酶在有氧呼吸末期催化乳酸的氧化。
　　 首先利用生物信息學(xué)篩選L.lactis中可能具有乳酸氧化活性的酶系。結(jié)果表明，非黃素含鐵硫簇的多亞基乳酸脫氫酶LutAB

4、C的同源蛋白編碼基因在L.lactis中普遍存在。由于LutABC蛋白復(fù)合物在Bacillus subtilis168中具有L-iLDH(NAD-independent L-lactatedehydrogenase)活性，因此L.lactis中LutABC同源物也可能具有L-iLDH活性。另一種具有L-iLDH活性的酶flavocytochrome b2在L.lactis中有兩種同源蛋白，一種是乳酸氧化酶，一種是Ⅱ型IPP異構(gòu)酶，但只有

5、Ⅱ型IPP異構(gòu)酶能夠同時(shí)滿足在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化的幾個(gè)條件，因此可能具備L-iLDH活性并參與有氧呼吸末期L.lacits對乳酸的利用。除已知L-iLDH及其同源物以外，屬于發(fā)酵型L-nLDH(NAD-dependent L-LDH)的LDHA在L.lactis中也普遍存在并有乳酸氧化活性，因此有可能參與呼吸末期細(xì)胞對乳酸的利用。
　　 繪制L.lactis在呼吸及發(fā)酵條件下的生物量和代謝產(chǎn)物的時(shí)間曲線，分

6、別在兩種培養(yǎng)方式的指數(shù)生長期和穩(wěn)定期收集細(xì)胞制備粗酶，測定L-nLDH和L-iLDH活性。結(jié)果表明，L.lactis的L-iLDH活性非常微弱，與培養(yǎng)方式及培養(yǎng)時(shí)期無關(guān)。與此不同的是，L.lactis的L-nLDH活性始終非常顯著，即便在發(fā)生乳酸利用的有氧呼吸穩(wěn)定期也是如此。
　　 利用pQE30Xa載體構(gòu)建Ⅱ型IPP異構(gòu)酶編碼基因fni的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli M15進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE分析表明重組FNI單亞基分子量

7、為41.17 kDa。光譜掃描結(jié)果顯示FNI屬于黃素蛋白。1H NMR分析表明，重組FNI能夠有效催化IPP異構(gòu)化生成DMAPP，證實(shí)純化的重組FNI具有顯著的生物學(xué)活性。經(jīng)nLDH和iLDH活性測定，重組FNI的兩類乳酸氧化活性都非常低，降低酶的添加量或是向反應(yīng)體系中加入二價(jià)金屬離子都會(huì)導(dǎo)致活性進(jìn)一步降低至無法檢測到。
　　 本研究設(shè)計(jì)了一種新的用于測定nLDH的乳酸氧化活性方法，可以測定呼吸條件下NADH的移除對乳酸氧化活性

8、的影響。用pEASY載體表達(dá)生成H2O的NADH氧化酶基因noxE，并用2，4-二硝基苯肼測定添加或不添加NoxE時(shí)丙酮酸生成量的變化。經(jīng)測定，重組NoxE具有顯著的NADH氧化活性。以新的添加有NoxE的反應(yīng)體系下測定FNI的乳酸氧化活性，活性沒有明顯提高。
　　 參照表達(dá)fni基因的程序構(gòu)建LDHA的編碼基因ldh的表達(dá)載體，最終獲得E.coli M15(pREP4，pQELDH)重組菌株。SDS-PAGE分析表明該重組菌株

9、可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)大小正確的重組蛋白。然而多次測定酶活都檢測不到有明顯的活性。因此有必要重新構(gòu)建LDHA的表達(dá)菌株。
　　 選用6×His標(biāo)簽位于C端的pEASY載體表達(dá)ldh基因。參照表達(dá)noxE的程序構(gòu)建ldh基因的表達(dá)載體，獲得重組菌株E.coli Transetta(DE3)(pEASY-LDH)。SDS-PAGE分析表明重組LDHA單亞基分子量為37.24 kDa，大小正確。在不添加FBP情況下，LDHA的丙酮酸還原活性很微

10、弱;當(dāng)添加1mM的FBP(fructose1，6-bisphosphate)后，丙酮酸還原活性驟然提高了7000多倍。結(jié)果表明，利用pEASY載體構(gòu)建的表達(dá)菌株能夠表達(dá)具有顯著L-nLDH活性的重組LDHA，這種活性強(qiáng)烈依賴于FBP的激活。
　　 酶動(dòng)力學(xué)研究表明LDHA對正反應(yīng)底物的親和力以及催化正反應(yīng)的最大速率都要顯著高于逆反應(yīng)，因此LDHA傾向于催化丙酮酸還原反應(yīng)。FBP和磷酸鹽對LDHA活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)BP和磷

11、酸鹽對LDHA的活性有顯著的調(diào)節(jié)作用。然而二者對兩個(gè)方向反應(yīng)的激活或抑制程度是相同的，因而不會(huì)改變反應(yīng)平衡。結(jié)果表明，腺嘌呤核苷酸對LDHA具有抑制作用，ATP對正、逆反應(yīng)的抑制微弱而且程度相似。ADP的抑制作用明顯，屬于競爭性抑制類型。整體而言，ADP對逆反應(yīng)有相對抑制作用，然而這種抑制程度強(qiáng)烈依賴于NADH、NAD、ADP之間的濃度關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NADH/NAD比率對反應(yīng)平衡影響很大。LDHA的丙酮酸還原活性在很寬

12、泛的NADH/NAD范圍內(nèi)受到的影響不大。另一方面，逆反應(yīng)速率只在NADH/NAD比率很低時(shí)才顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LDHA對丙酮酸的親和性隨著NADH濃度的降低而降低。乳酸對正反應(yīng)的抑制作用很弱，而丙酮酸對逆反應(yīng)有著強(qiáng)烈的抑制作用。
　　 利用本研究設(shè)計(jì)的方法來評(píng)估LDHA在NADH可以被移除的條件下乳酸氧化活性的變化。結(jié)果表明，在添加NoxE后LDHA的乳酸氧化活性提高了2.84倍。因此在有氧呼吸條件下，LDHA催化乳酸氧化

13、的活性會(huì)明顯提高。
　　 細(xì)胞內(nèi)代謝物分析結(jié)果表明，胞內(nèi)ADP的濃度在有氧呼吸指數(shù)生長期和穩(wěn)定期始終維持在一個(gè)很低的水平，胞內(nèi)NAD的濃度也基本維持恒定。然而當(dāng)培養(yǎng)物進(jìn)入到穩(wěn)定期以后，胞內(nèi)NADH和丙酮酸的濃度顯著降低。根據(jù)上述結(jié)果，穩(wěn)定期細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物的濃度利于LDHA催化乳酸氧化反應(yīng)。
　　 本研究首次證實(shí)發(fā)酵型nLDH負(fù)責(zé)催化L.lactis有氧呼吸末期乳酸的氧化并提出發(fā)生乳酸氧化的先決條件以及相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途