Lactococcus lactis食品級誘導表達系統(tǒng)構建及銅綠假單胞菌融合外膜蛋白的表達.pdf

1、乳酸菌是在食品、醫(yī)藥等領域廣泛應用的微生物，用乳酸菌構建以非抗生素抗性為選擇標記的食品級載體的研究越來越為人們所關注。 NICE(TheNisin-Controlled Expression)系統(tǒng)是有效的食品級誘導表達系統(tǒng)。乳酸菌NICE系統(tǒng)是在乳鏈菌肽誘導下由nisA啟動子控制目的基因的表達，含nisR和nisK的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的高效誘導表達系統(tǒng)。由于NICE系統(tǒng)的誘導劑、宿主菌和載體都是食品級的，構建乳酸菌NICE系統(tǒng)食品級

2、表達載體，將集益生菌生物功能和外源基因表達產(chǎn)物活性于一體，在食品和醫(yī)藥方面有著很好的應用前景。 在目的蛋白生產(chǎn)和發(fā)酵中，由于乳酸菌分泌表達可使乳酸菌生產(chǎn)的異源蛋白質前體避免水解，異源蛋白質表達量更高，以同源的乳酸球菌SPUsp45指導目的蛋白的分泌表達并且目的基因與SPUsp45，Nuc和LEISSTCDA的融合體可提高分泌表達效率，因而乳酸菌分泌表達更有意義。 本研究利用食品級a-aga選擇標記代替抗生素抗性選擇標記，

3、并利用nisA啟動子、nisR、nisK和SPUsp4s/nucA/cwaM6/t1t2基因，以乳酸球菌作為宿主菌，以乳鏈菌肽作為誘導分子，構建更為安全穩(wěn)定的乳酸菌食品級高效誘導細胞質和細胞分泌表達的θ型復制載體系統(tǒng)。OprF/H為本實驗室構建，是銅綠假單胞菌外膜蛋白組分F和H的融合蛋白，具有良好的免疫原性，為檢測該系統(tǒng)的可行性，將OprF/H基因克隆入構建的載體中，在乳酸球菌中進行高效誘導細胞內(nèi)和細胞壁分泌表達，為利用此兩種載體表達各

4、種外源性和內(nèi)源性的功能基因提供理論和技術依據(jù)，同時也為研制有效的防治銅綠假單胞菌的新型疫苗提供思路。 從L.lactisSMQ719/pRAF800中提取到食品級載體pRAF800，根據(jù)公布的pRAF800的復制子序列，設計引物擴增rep基因，經(jīng)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ酶切，利用T4連接酶與pMG36e的Emr連接。連接產(chǎn)物用電轉化法轉入L.lactisNZ9000中，經(jīng)Em篩選、克隆子鑒定，獲得重組質粒pEmr∶rep。用限

5、制酶HindⅢ酶切pEmr∶rep，pEmr∶rep經(jīng)綠豆核酸酶削平，T4連接酶連接，獲得含Emr的θ復制子缺失載體pEmr∶Arep。 然后以pNZ8048DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的PnisA和TpepN序列，設計引物擴增出大小為312bp的PnisA-MCS-TpepN基因片段，再用限制酶XbaⅠ酶切pRAF800和PnisA-MCS-TpepN基因，用T4連接酶將PnisA-MCS-TpenN基因與去磷酸化的線性pRAF8

6、00進行連接，用電轉化法將連接產(chǎn)物轉入L.lactisNZ9000感受態(tài)細胞中，在Mel-EL1和Mel-BCP培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，根據(jù)a-aga酶特殊代謝底物-蜜二糖的食品級顯性選擇標記篩選陽性克隆子并進行克隆子鑒定，獲得含有a-aga和PnisA-MCS-TpepN的乳酸球菌食品級細胞內(nèi)誘導表達載體，命名為pRNA48，其大小為4.5kb。以同樣方法在pRAF800的XhoⅠ位點上克隆入PnisA-MCS-TnepN獲得另一食品級

7、載體pRNB48。 以pVE5524為模板，根據(jù)已公布的SPUsp4s和t1t2的序列設計引物擴增出SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NheⅠ酶切，用T4連接酶與經(jīng)NcoⅠ和NheⅠ限制內(nèi)切酶酶切并去磷酸化的線性pRNA48連接，用電轉化法將連接產(chǎn)物轉入L.lactisNZ9000感受態(tài)細胞中，經(jīng)Mel-EL1和Mel-BCP培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)、篩選和克隆子鑒定，獲得含有a-aga和Pni

8、sA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2的乳酸球菌食品級高效誘導分泌表達載體，命名為pRNV48，其大小為6.0kb。利用nisin誘導L.lactisNZ9000/pRNV48分泌表達Nuc，使Nuc靶定到細胞壁上，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結果顯示表達的Nuc在1ng/mLnisin誘導3小時后達到峰值，經(jīng)TB-D平板檢測，表達產(chǎn)物是具有活性的Nuc。 為檢測構建的表達載體pRNA48和pRNV48是否可以

9、高效誘導表達外源基因，根據(jù)已知序列設計引物擴增出OprF/H基因，并將其克隆入載體pRNA48和pRNV48中，用電轉化法將重組載體轉入L.lactisNZ9000中，經(jīng)食品級選擇標記a-aga篩選和克隆子鑒定，獲得重組載體pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin進行重組乳酸球菌菌株的誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE，Westen-blot分析，以及與相應抗原的凝集反應證明，表達產(chǎn)物具有活性，表達蛋白分

10、別占細胞內(nèi)可溶蛋白的9.6％和細胞壁錨定蛋白的9.8％。 主要工作包括： 1.構建了含Emr的θ復制子缺失載體pEmr∶△rep。 2.成功構建了食品級載體pRNA48和pRNV48，可在乳酸球菌L.lactisNZ9000中進行θ型復制，并與L.lactisNZ9000宿主菌共同構成乳酸球菌NICE系統(tǒng)食品級胞內(nèi)和分泌表達系統(tǒng)。 3.構建的系統(tǒng)在nisin的誘導下，在胞內(nèi)表達了OprF/H融合蛋白，表達

11、產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，分子量為55KDa，當誘導時間3h，nisin終濃度為10ng/mL時，表達量達到最高值，占胞內(nèi)可溶蛋白的9.6％。經(jīng)Westen-blot檢測為活性蛋白。 4.構建的系統(tǒng)在nisin的誘導下，成功地將OprF/H融合蛋白錨定在細胞壁上，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，分子量為58KDa，最高產(chǎn)量占細胞壁錨定蛋白的9.8％。經(jīng)Westen-blot檢測為活性蛋白。 本研究構建的食品級載體可作為